Антигрибковое средство для стен своими руками

Антигрибковая обработка стен производится для предотвращения образования грибка и плесени. Это очень важный этап работ, который необходимо выполнять с высокой ответственностью и соблюдением всех требований инструкций.

Выбор антигрибкового состава должен производиться с учетом свойств материалов, из которых выполнены стены, и условий, в которых будет проходить эксплуатация обрабатываемых конструкций.

Противогрибковая грунтовка для стен наносится на обрабатываемую поверхность во время подготовительных работ и способна не только устранить плесень и грибок на стенах, но и предотвратить их появление в дальнейшем.

Виды антигрибковых грунтовок

Фунгициды в составе грунтовки убивают грибы и бактерии

Для борьбы с плесенью и грибком используют различные грунтовки, в основу которых добавляются фунгицидные вещества, способные препятствовать образованию и росту вредных микроорганизмов.

В большинстве своем такие растворы обладают также антибактериальными и антисептическими свойствами. В зависимости от состава антигрибковые грунтовки разделяются на:

• алкидные;
• минеральные;
• акриловые.

Грибок стены способен испортить финишное покрытие

При выборе противогрибкового средства необходимо внимательно изучить инструкцию по применению, так как не все антисептические грунтовки способны устранить плесень и грибок, а многие предназначены только для уничтожения вредителей и бактерий.

Кроме того, многие из них рекомендованы к применению для конкретного материала основания и способны достичь наибольшего эффекта при использовании для определенного вида обрабатываемой поверхности.

Грунтовки, используемые для борьбы с плесенью и грибком, могут разделяться на виды в зависимости от типа покрытия, на котором производится данная технологическая операция для:

• бетонного основания;
• конструкций, выполненных из дерева;
• кирпичных стен;
• покрытий из гипсокартона;
• поверхностей из пенопласта и пенополистирола;
• конструкций, обработанных шпаклевкой и гипсовой штукатуркой;
• стен, пола и потолка, покрытых цементными составами.

Все антигрибковые средства для обработки стен экологически безопасны, обладают высокой проникающей способностью и сохраняют свои свойства длительный период, достаточный для защиты обрабатываемой поверхности.

Выполнение антигрибковой грунтовки

Сначала необходимо зачистить участки плесени

Перед нанесением грунтовочного средства непосредственно на обрабатываемую поверхность необходимо выполнить подготовительные работы, направленные на устранение имеющихся грибковых заражений и предотвращение их образования в дальнейшем.

Не следует наносить антигрибковый раствор непосредственно на плесень или грибок, так как это будет не эффективно без удаления поврежденных мест и обработки их специальными составами.

На очищенную поверхность наносите грунт в несколько слоев

Качественное грунтование пропиткой может быть выполнено только по тщательно подготовленной для этого поверхности. Подготовка заключается в выполнении следующих мероприятий:

1. Обрабатываемую поверхность необходимо вычистить. При необходимости ее можно вымыть горячей водой. Для устранения плесени в горячую мыльную воду добавляют различные составы, способствующие ее скорейшему уничтожению, например, “Белизну”, которая считается оптимальным вариантом для обработки подготавливаемых поверхностей.
2. При обработке кирпичных и оштукатуренных поверхностей целесообразно будет применить паяльную лампу для уничтожения глубоко въевшегося в них грибка.
3. Далее, осуществляется сушка вымытой и очищенной поверхности. Для качественного и ускоренного выполнения этой процедуры можно использовать строительный фен или тепловентилятор особенно во влажных помещениях.

При выполнении подготовительных работ не стоит забывать о необходимости выполнения мероприятий, предотвращающих возможность появления плесени и грибка в дальнейшем. Подробнее об избавлении от грибка смотрите в этом видео:

После выполнения вышеперечисленных мероприятий производится нанесение грунтовочного состава на обрабатываемую поверхность. Выполняется эта операция при помощи кисти, валика или пульверизатора при обязательном использовании средств индивидуальной защиты.

Обработка деревянных поверхностей

Соскобленный грибок лучше всего поместить в пакет и сжечь, чтобы споры не разлетелись по всей квартире

Нанесение грунтовки от плесени и грибка на деревянные конструкции представляет собой несколько иные технологические операции, которые необходимо выполнять в строгом соответствии с инструкцией, приложенной к специализированному составу.

• в первую очередь металлической щеткой или скребком соскабливают плесень и грибок с зараженных участков;
• инструмент после выполнения работ на каждом участке или в определенный промежуток времени между перерывами в работе тщательно обрабатывают антисептиком;
• соскобленный материал собирают в металлическую тару и затем сжигают, не давая тем самым возможности плесени или грибку закрепиться на новом месте;
• прочищенные участки древесины тщательно промывают горячей водой с добавлением моющих средств, перекиси водорода, медного купороса, пищевой соды или уксуса;
• после тщательной промывки и просушки поверхности ее обрабатывают антигрибковой грунтовкой.
• древесину также пропитывают антибактериальными препаратами. О выборе антисептика для деревянных покрытий смотрите в этом видео:

Все препараты, используемые в подготовительный период и во время антигрибковой обработки поверхности, вредны для человека, поэтому в процессе выполнения этих работ его участникам необходимо использовать защитные очки, респиратор, резиновые перчатки, плащи, сапоги и другие средства защиты, необходимые для предотвращения попадания вредных веществ в дыхательные пути, на кожу и другие части тела и органы человека.

В зависимости от степени поражения обрабатываемых конструкций плесенью и грибком антигрибковая грунтовка для стен может быть двух видов:

Вид грунтовки	Область использования	Цель применения
Обычный раствор	Не зараженные участки	Профилактика и предупреждение
Концентрат грунтовочного состава	Конструкции, пораженные плесенью и грибком	Уничтожение плесени, грибка и даже мха с лишайником

Используйте средства индивидуальной защиты

Если в помещении не обнаружены признаки плесени и грибка, все равно необходимо проводить пропитку основания антигрибковыми растворами и выполнить мероприятия, препятствующие образованию плесени и грибка, а именно устройство качественной вентиляции, гидро- и теплоизоляции.

Медный купорос от грибка на стенах в квартире

Медный купорос от грибка плесени на стенах в квартире, доступное, эффективное средство. Сульфат меди или соль медной кислоты хорошо растворим в воде, из водного раствора кристаллизируется химическое соединение: пятиводная сернокислая медь CuSO4·5h3O – медный купорос. В природе встречается как минерал халькантит.

Водный раствор медного купороса широко используется для предотвращения гниения деревянных, кровельных покрытий, при удалении ржавчины с труб при протечках, очищает выделения соли (высолов) с бетонных, кирпичных поверхностей. Обладает фунгицидными, антисептическими и огнеупорными свойствами, что особенно важно при обработке деревянных поверхностей. Водный состав сернокислой меди наносят на поверхность как профилактическую, антибактериальную основу перед нанесением других покрытий. Продается медный купорос в хозяйственных и строительных торговых точках, в магазинах все для сада и огорода.

Несмотря на полезные свойства, плесневые грибы могут причинить серьезный вред здоровью человека. Плесневый налет возникает как небольшое пятно на поверхности. Очаг пораженной площади постепенно увеличиваются, затрагивая глубокие слои материала. Споры грибка плесени в огромных количествах постоянно присутствуют в воздухе в «спящем» состоянии, до появления благоприятных условий их размножения. Благоприятными условиями их размножения является- теплая, сырая питательная среда. Любая поверхность, пораженная грибковой гнилью, приводит ее к физическому разрушению. Плесневые грибы распространяются повсеместно колониями, поражают потолки, стены квартиры под обоями, ванную и туалетную комнату, кухню, а также бетонные, кирпичные, деревянные поверхности.

Главное место нахождения человека — дом. Если в доме повышенная влажность, плохая вентиляция, как результат в вашем доме поселится грибок плесени. Если не начать своевременную борьбу по выведению грибка, то будут поражены и повреждены стены, потолки, мебель, пол и причинить серьезный вред здоровью проживающим в доме.

Основные причины и признаки появления плесени в квартире

Причина возникновения плесени в квартире — высокая влажность, теплый воздух, нарушение работы системы вентиляции.

Появление грибка на наружных панелях дома, на потолках говорит о дефекте стройматериалов или некачественной кладке, некачественных швах между панелями. Основанием к образованию налета может еще стать не утепленные стены, промерзание панели, скопление конденсата между швами. Грибковый налет образовывается на бетонных, кирпичных и деревянных стенах, при повышенной влажности и плохой вентиляции.

В ванной и туалетной комнате, на кухне плесень появляется также из-за избыточной влажности и плохой вентиляции. Причиной возникновения может быть не герметичность, протечка водопроводных труб, неисправность вентиляции, некачественная герметизация стыка ванны и облицовочного материала стены, наличие протечки труб канализации. Если герметичность нарушена, через него просачивается вода. Это приводит к образованию луж в плохо вентилируемых местах ванной комнаты, возникает гниль, сырость. Постоянное скопление воды в примыканиях на полу ванной комнаты приведет к протеканию воды на нижние этажи или в подвал.

Если квартира на нижних этажах или частный дом причиной избыточной влажности может стать сырой подвал.

Поражение стен дома плесневыми грибами имеет характерные признаки:

• Первый признак наличия -это сырой запах «погреба»;
• Грибковый налет быстро разрастается в очагах поражения, разрушает пораженный материал.

Существуют разные способы и методы борьбы по выведению грибковой плесени, самым популярным за счет действенности, экономичности-является обработка пораженных поверхностей водной смесью медного купороса.

Подготовка стен

Для того чтобы наши усилия по устранению плесени не оказались пустыми, следует совершить следующие действия:

• Первый шаг по устранению налета-обнаружить затем устранить очаг и причину возникновения. Обследовать все поверхности, углы, трубы, канализации, стыки стен, подвал, устраняются причины образования сырости. Обеспечить воздухообмен, для полноценного притока воздуха.
• Зачистить всю пораженную поверхность с использованием щеток, шпателя, наждачных шкурок.
• Если грибок проник в глубокие слои стены, надо до нее добраться, зачистить, нейтрализовать главную грибницу, если нужно заменить фрагмент, для этого шпателем снимать все слои краски или обои до основания.
• Чтобы добиться большей эффективности помыть поверхность мыльным раствором.
• Следующий шаг: просушить после зачистки.
• Обрабатываем стены фунгицидной смесью сернокислой меди.

Для обработки медным купоросом подвала или погреба, надо освободить погреб от всех полок, шкафов, ящиков из дерева и вынести на улицу. Если деревянные предметы сильно поражены гнилью, то их лучше заменить. Если повреждение частичное, оставить их на просушку на солнце, так как ультрафиолетовые лучи убивает грибок, затем обработать паяльной лампой. А сам погреб очистить и обработать составом все поверхности.

Порядок обработки

Следует соблюдать порядок и инструкцию по применению при обработке помещения фунгицидным составом:

• В 10 литрах теплой воды растворить от 100 до 400грамм купороса, перемешать до полного растворения;
• Валиком или малярной щеткой, или просто губкой нанести на всю обрабатываемую поверхность приготовленный состав, затем просушить;
• Сушить 5-6 часов или строительным феном. Наносить готовую смесь можно с помощью кисти, валика, губки или распылителя;
• Наносить можно до 5 слоев, но после каждого слоя нужно выдерживать время сушки.
• Пользоваться обработанным помещением можно не раньше, чем через 2- ое суток, предварительно хорошо проветрить.

Меры предосторожности

Медный купорос токсичен, с ним следует работать очень осторожно:

• Приготовить антигрибковую смесь непосредственно перед применением, использовать в течении 10 часов.
• Смесь готовить и хранить не в металлической емкости. Медь разъедает железо и другие металлы.
• Токсичные пары сульфата меди вызывает отравление и рвоту, использовать с осторожностью. Соблюдать меры безопасности, одевать на лицо респиратор или маску. Нельзя допускать при работе пыление порошка, после окончания обработки необходимо помыть лицо.
• Сам порошок безвреден для сухой кожи, но его необходимо смыть. Работать в резиновых перчатках и закрытой одежде.
• Во время обработки помещения антибактериальным составом, включить вытяжку или открыть окно.
• При отравлении парами соли меди срочно обратиться к врачу.

После обработки раствором сернокислой соли помещения, не допускать условий для повторного появления грибка. Следить за влажностью, воздухообменом и температурой в помещении. Оставлять зазоры между стеной и мебелью для циркуляции воздуха. Следить за состоянием водопроводных труб и сантехники. Регулярно проветривать квартиру. После качественной обработки стен антигрибковым составом и соблюдении вышеперечисленных условий, повторное образование плесневых грибков исключено.

Мне нравится14Не нравится1

Виды антигрибковых средств для стен: состав, применение. | Пенообразователь Rospena

Вопрос покупки антигрибковой смеси поднимается потребителями и заказчиками ремонта жилых помещений только при явном поражении плесенью. При этом антигрибковая обработка стен желательна в 90% случаев для профилактики в новых домах, и в 100% случаев – во вторичном секторе. Это связано с особенностями попадания в квартиры и размножения плесени. Грибки находятся в воздухе, но оседают и начинают размножаться только при определенных условиях – теплоты и влажности. Именно эти параметры характерны для помещений, и появление плесени при наличии условий – это дело времени.

Обработка стен антигибковой смесью полезна в 90% случаев

Обработка стен антигибковой смесью полезна в 90% случаев

Противогрибковая грунтовка – назначение, свойства и применение

Производителями предложен широкий спектр предложений против грибков, но каждый продукт обладает своими параметрами. Учитывайте, только профессиональные варианты рассчитаны на глубокую санацию поверхностей и полное избавление от плесени. Основная масса предложений обеспечивают только эффективную профилактику. Противогрибковая грунтовка для стен, как правило, наносится после полного удаления поврежденной штукатурки с несущей поверхности здания. Это делается с целью создания барьера между кладкой и новым слоем штукатурки – причем желательно цементно-известковой.

Строительные смеси обычно не рассчитаны на повторное использование. Применяться многократно может только поврежденная грибком глина, причем при условии нанесения раствора, изготовленного с добавлением извести. Известь и глина помогают избавиться от проблемы. Если штукатурка наносится по деревянному основанию саманного, каркасного или брусового дома, рекомендуется предварительная окраска поверхностей самостоятельно приготовленной санирующей жидкостью на основе медного купороса.

Производители предлагают много различных смесей против грибка

Производители предлагают много различных смесей против грибка

Все антигрибковые средства содержат в составе фунгициды и основу, создающую барьер (акриловую, минеральную, алкидную, латексная и др.). Для эффективности применяется обеззараживающая композиция, обеспечивающая одновременно антибактериальную и антисептическую защиту. Отличие антисептиков от фунгицидов состоит в том, что первые обеспечивают кратковременную санацию, вторые – долговременную. Противоплесневые качества жидкого покрытия зависят от объема содержания определенных веществ, действующих против грибка, и их проникающей способности.

В зависимости от целей и используемых веществ для приготовления противогрибковой грунтовки может изменяться назначение, свойства и применение. Например, некоторые продукты используются для поверхностной обработки для областей, пораженных плесенью, другие – создают надежную защиту для нового слоя штукатурки. В зависимости от используемой основы могут быть обработаны бетонные, кирпичные, полистирольные основания, мелкопористые и крупнопористые материалы.

Выбирайте средства исходя из особенностей пораженной зоны

Выбирайте средства исходя из особенностей пораженной зоны

Виды грунтовок против грибка по назначению

Различие продукции против плесени по назначению помогает производителям предложить продукцию по категориям. При этом учитываются потребности покупателей и особенности тех работ, которые им требуется выполнить. Назначение подразумевает разную концентрацию противоплесневых компонентов. Различается и основа, зависящая от типа работ, которые проводились или будут проводиться «до» и «после» нанесения.

В продаже можно встретить санирующие жидкости, применяемые в момент проведения капитального или косметического ремонта:

• эмульсии – для создания защитного санирующего слоя между возможно пораженной поверхностью и новым слоем отделки;
• концентраты – для «лечения» от грибка;
• грунтовочные смеси – для профилактической обработки.

Грунтовка против грибка выбирается исходя из предстоящих работ

Грунтовка против грибка выбирается исходя из предстоящих работ

К наиболее востребованным относятся следующие продукты: Ферозит (на минеральной основе), MilKill(на латексной основе), «Acryl Grundierung» (на акриловой основе) от немецкой ТМ Олимпик. В данном случае при выборе нужно обращать внимание:

• на глубину проникновения и эффект – в зависимости от характера поражения грибком;
• на основу используемых материалов, чтобы обеспечить максимальную адгезию.

Большинство основ без особых проблем совмещаются между собой. Однако, при использовании только латексных или акриловых продуктов значительно улучшаются эксплуатационные характеристики. Различные антибактериальные добавки помогают решить проблему плесени в долгосрочной перспективе.

Для борьбы с сильным поражением плесенью используют специализированные и профессиональные концентраты. Наиболее популярными средствами от грибка считаются следующие.

• CT99 бренда Ceresit – концентрат для фунгицидного санирования помещений, применяется для обработки фундаментов, вертикальных поверхностей. Обеспечивает длительный эффект, а при соблюдении технологии позволяет полностью избавиться от проблемы.
• Олимп Стоп Плесень для экспресс-обработки без необходимости удаления пораженного грибком слоя.
• спрей-концентрат NEOMID BIO для сканирования небольших участков или для профилактики мест, которые намокли.
• ФОНГИФЛЮИД АЛЬПА – активный фунгицид для всех видов поверхностей без нанесения повреждений. Применяется внутри и снаружи помещения. Выпускается в объемах для строительной обработки и в виде спрея для бытового использования.
• БИОЦИД – очень мощное немецкое средство, двукратная покраска обеспечивает полное уничтожение плесени и грибков.
• антисептик ДАЛИ для всех видов поверхностей, включая дерево и гипсокартон.

Выбор концентратов и строительных растворов от грибков обычно делается в зависимости от доступности продукта, стоимости, характера обработки и преследуемых целей.

Смесь Стоп-Плесень применяется для экспресс обработки пораженной зоны

Смесь Стоп-Плесень применяется для экспресс обработки пораженной зоны

Виды грунтовок по составу

По названию приведенных выше концентратов от грибков можно определить некоторые вещества, входящие в состав. Как правило, концентраты основаны на композиции фунгицидных препаратов. Исключением является биоцид. Буквально название переводится как «уничтожение жизни», это касается микроорганизмов. Для человека натуральный или синтетический биоцид в допустимых дозах безвреден. Его также применяют в фармацевтических целях для придания неспецифических антибактерицидных свойств препаратам, в качестве консерванта в пищевой промышленности.

В широком понимании к биоцидам относятся пестициды (ядохимикаты), включая фунгициды для подавления грибков (бордосская жидкость, формалин) и гербициды (для подавления растительности, лишайников), антисептики и антибиотики. Немецкий антигрибковый концентрат Биоцид представляет собой запатентованную комплексную формулу.

Выбирать грунтовку против грибка нужно тщательно

Выбирать грунтовку против грибка нужно тщательно

Готовые грунтовочные жидкие покрытия могут отличаться по составу:

• в зависимости от выбранной основы, об этом говорилось выше;
• универсальные смеси, обеспечивающие защиту от всех видов потенциальных инфекций;
• смеси направленного действия на основе одного из препаратов.

Для профессиональной обработки выпускаются специализированные фунгициды, которые используются для прямого нанесения или изготовления санирующей жидкости. К эффективным доступным способам относят ветеринарный Бутокс и аналоги, медный купорос (100 г на 10 литров), хлорный отбеливатель «Белизна» (чистый или 1:10 водный раствор). Для профилактики используется также натр (1 ст. л. соды, 200 г воды, 2,5 л стирального порошка с фосфатами), хозяйственные помещения белят известью.

Лучшим готовым продуктом, по отзывам, является доступный ФОНГИФЛЮИД АЛЬПА. Обратите внимание, что он не создает пленку, то есть это не специфическая строительная антигрибковая грунтовка. Антигрибковую жидкость наносят до грунтовочного слоя глубокого проникновения. Также можно приготовить грунтовочную жидкость самостоятельно с добавлением готового раствора Schimmelstopp Dufa, а также сельскохозяйственного фунгицида или ветеринарного пестицида. Это может быть, например, Глютекс, Абсолюцид, противогрибковый Бицин и другие.

Проведенный анализ описывает несколько самых эффективных антигрибковых средств для стен и представляет собой сравнительный обзор лучших вариантов, представленных в магазинах. В том числе, предложенные продукты могут быть использованы для самостоятельного изготовления строительных растворов.

Лучшим готовым продуктом, по отзывам, является доступный ФОНГИФЛЮИД АЛЬПА

Лучшим готовым продуктом, по отзывам, является доступный ФОНГИФЛЮИД АЛЬПА

Грунтовки для проведения профилактики от плесени

Практически все продукты, предложенные в строительных магазинах, предназначены только для профилактики грибкового поражения. Преимущественно они используются для нанесения финишного грунтовочного слоя после опрыскивания фунгицидами и не заменяют «лечение» стен.

Все смеси против грибка предназначены для профилактики

Все смеси против грибка предназначены для профилактики

Противогрибковые средства по дереву

При поражении плесенью древесины считается, что уже невозможно полностью избавиться от данной проблемы. Пораженное дерево обычно полностью заменяют. Мощным способом восстановления древесной фактуры являются концентраты Биоцид и ФОНГИФЛЮИД, но нельзя дать гарантию 100% решения проблемы. В качестве профилактики применяются пропитки на основе медного купороса или готовая к применению бордосская смесь. Из готовых строительных смесей рекомендуют Dufa-Holzlasur, Борамон С30, Pinotex Base для наружного применения.

При поражении плесенью дерева, полностью избавиться от нее не получится

При поражении плесенью дерева, полностью избавиться от нее не получится

Эмульсии для борьбы с плесенью

Антигрибковая грунтовка для стен в виде эмульсии по своей структуре представляет собой жидкость, наполненную каплями другой жидкости. В строительном деле этот вид покрытия представляет собой готовые концентраты с направленным действием для внутренней и внешней санации поверхностей. К популярным средствам среди мастеров, кроме вышеназванных, считается эмульсия Mixonit GR43.

Эмульсии используют как для внутренней так и для внешней обработки

Эмульсии используют как для внутренней так и для внешней обработки

Выполнение антигрибковой грунтовки

Антигрибковая грунтовка наносится на очищенное основание. Это делается механическим или химическим способом. Принято сбивать пораженный слой, если это невозможно или нежелательно делать, то проводится обработка поверхности, например, чистой «Белизной». Промыть механически очищенную поверхность можно также 30% водным раствором хлорки, это поможет избавиться от оставшихся в растворе или кирпиче спор.

Антигрибковая грунтовка для стен кроме фунгицидных свойств, обеспечивающих профилактику плесени, должна обеспечивать свои основные функции – улучшение адгезии материалов. Далее наносится краска или декоративная штукатурка. Преимуществом средства ФОНГИФЛЮИД считается отсутствие пятен или разводов после нанесения.

Антигрибковая грунтовка наносится на очищенное основание

Антигрибковая грунтовка наносится на очищенное основание

Опасность от грибков и плесени

Если вы хотите проигнорировать противогрибковую обработку, обратите внимание, что плесень может способствовать появлению ряда заболеваний:

• аллергии;
• астме;
• грибковому поражению кожи и внутренних органов, преимущественно дыхательных;
• онкологическому поражению.

Проживание в комнатах, пораженных грибком, запрещено санитарно-эпидемиологическими нормами, а у детей может вызвать серьезные поражения организма. Своевременная антигрибковая грунтовка перед покраской поможет провести профилактику развития спор.

Грибок в комнате может вызвать проблемы со здоровьем

Грибок в комнате может вызвать проблемы со здоровьем

Признаки и причины образования грибка

К причинам возникновения грибка на стенах относят:

• повышенную влажность в помещении;
• предварительную загрязненность спорами и недостаточную обработку помещения;
• плохо выполненную гидроизоляцию;
• течь в потолке и стенах;
• недостаточную вентиляцию;
• эффект термоса при нарушении технологии утепления жилых помещений.

Задуматься о возможном поражении плесенью необходимо, если у вас протекает потолок или подмочены стены от фундамента (нет слоя гидроизоляции между стяжкой и кирпичной кладкой). После установки пластиковых окон и утепления при нарушении естественной циркуляции воздуха. Плесень проявляется в виде пятен на стенах и потолке, сначала желтоватых и рыжих, затем по мере прорастания спор и распространению грибка приобретающих черный цвет.

Антиплесень для стен

Для полной защиты вашего дома, вам может потребоваться средство против грибка на стенах. С этой проблемой борются уже не одну сотню лет. И выходом из ситуации стало производство антигрибкового состава, который по всем своим показателям является надёжным «борцом» за ваше здоровье. В состав продукта входят только самые современные химические элементы, которые надёжно уничтожают плесень, грибки, водоросли, мхи и другие вредоносные микроорганизмы. Так же антигрибковая смесь класса стандарт является хорошим бактерицидным средством, т.е. в состав её входят антисептики.

 

Способы применения антигрибка стандарт:

Антигрибок стандарт применяется в помещениях для уничтожения плесени и других вредоносных формирований. При образовании плесени и грибка на стенах возникает риск заразиться различного рода болезнями. Поражается в основном дыхательная система человека, так как микроорганизмы распространяют свои споры, которые воздушно-капельным путём могут оказаться в организме человека и нанести тяжёлый урон здоровью. В связи с этим, наша организация рекомендуют незамедлительно избавиться от всех видов вредных микроорганизмов.

Применяется средство против грибка на стенах класса стандарт с помощью воды, средств нанесения и строительных материалов. Во-первых, вам следует растворить наши антигрибки в пропорции один к девяти, если это один из строительных материалов (побелка, шпатлевка, грунтовка и др.). Если же это водоэмульсионная краска, то пропорция будет составлять один процент от всей массы смеси. Во-вторых, обязательно разбавить водой для лучшего связывания смеси с поверхностью. Далее вам потребуется очистить поверхность от всех неровностей, для лучшего проникновения смеси в материал. Наложение раствора на поверхность в основном проделывается от одного до трёх раз, в зависимости от материала.

Отличительной особенностью антигрибка МОНОМАХ является его хорошее качество по низкой цене. Многие думают, что дешевое средство от плесени и грибка может быть некачественным. Однако это говорит лишь о том, что производство нашего продукта характеризуется новейшими технологиями, которые помогают уменьшить издержки на нашем производстве.

Средства против грибка на стенах производства «МОНОМАХ» дают нам возможность не тратить много времени по поиску альтернатив. Так как товары нашей фирмы не уступают, а во многом даже и превосходят товары признанных мировых производителей. Покупайте наши качественные товары по приемлемым ценам.

Террастерил антигрибковый раствор —

Описание

Грунтовка обеззаражиающая Terraco Террастерил (Террако)

ОПИСАНИЕ:
Антибактериальный, обеззараживающий раствор, используемый для очистки стен от проявлений плесени, грибковых наростов, лишайников, мха и т.д.
Наносится при подготовке стен к окрашиванию или перед любой другой отделкой поверхности.
Применяется как при внутренних отделочных работах, так и при наружных.
Эффективен для стен из кирпича, бетона, оштукатуренных поверхностей.
Не наносится на гипсовые, деревянные и металлические поверхности, а также на окрашенные масляными красками или известковым раствором.

СВОЙСТВА:
– легко наносится
– может применяться не только для профилактических работ, но и для обработки уже зараженных участков стен
– при условии правильного применения гарантирует полное избавление от плесени
– проникает глубоко в структуру материала, обеспечивая надежную антисептическую защиту, особенно для пористых поверхностей

МЕРЫ ПРЕДОСТОРОЖНОСТИ:
Избегайте попадания в глаза и на кожу. В случае попадания в глаза промойте не позднее чем через пятнадцать.
При попадании паров материала в дыхательные пути выйдите на свежий воздух и постарайтесь пить как можно больше воды.
При работе используйте перчатки и предохраняющие очки.

ОБЛАСТЬ ПРИМЕНЕНИЯ:
Террастерил используется для обработки внутренних и внешних поверхностей стен из кирпича, штукатурки, бетона и других материалов, кроме металлов и дерева.
Применяется строго до нанесения отделочных материалов.

НАНЕСЕНИЕ:
Нанесение ТЕРРАСТЕРИЛА производится с помощью кисти, валика или распылителя. Стена обильно смачивается грунтовкой таким образом, чтобы вся поверхность полностью пропиталась раствором.
Далее необходимо щеткой или наждачной бумагой удалить с поверхности плесень и грибки, параллельно смачивая ее ТЕРРАСТЕРИЛОМ. В завершение обрабатываемая поверхность моется чистой теплой водой.
В особо сложных ситуациях, когда степень зараженности велика, необходимо повторить всю процедуру несколько раз. В этом случае может потребоваться несколько дней для достижения желаемого результата.
Для улучшения эффекта рекомендуется проводить обработку при сухой теплой погоде.
После окончательной очистки поверхности от заражений необходимо нанести еще один слой ТЕРРАСТЕРИЛА, что полностью предотвратит повторное появление плесени.

ХРАНЕНИЕ:
Хранить грунтовку рекомендуется в чистом, сухом месте, предохраняя от воздействия прямых солнечных лучей.
Нежелательно подвергать материал сильному переохлаждению или нагреванию.
В закрытом состоянии канистры с грунтовкой хранятся без потери качества материала в течение года.
Все же, во избежание потерь, желательно использовать вначале те материалы, которые изготовлены раньше.
TERRACO предлагает большой выбор строительных отделочных материалов и услуг.
Отдел Технического обслуживания TERRACO или местный агент могут предоставить более детальную информацию, образцы, провести демонстрацию нанесения материалов по просьбе заказчиков.
Информация, приведенная здесь, основана не только на наших лабораторных исследованиях, но и на практическом опыте, полученном в процессе отделочных работ на строительных площадках.
Вся продукция продается в соответствии со стандартными условиями продаж, которые могут быть предоставлены по просьбе покупателя.
Эта информация основана на современном уровне знаний TERRACO, она предназначена для того, чтобы дать общую информацию о материалах TERRACO и методах их применения.
Потенциальному покупателю рекомендуется убедиться в соответствии материалов, предложенных TERRACO, своим потребностям перед тем, как приобретать их в коммерческом масштабе.

ТЕХНИЧЕСКИЕ ДАННЫЕ
Продукт Раствор, стерилизующий на водной основе
Связующие Акриловые
Цвет Белый, прозрачный
Метод нанесения Валик, кисть распылитель и т.п.
Пожароопасность Класс 0
Расход 0,1-0,2 кг. на 1 кв.м. поверхности.
Время высыхания 12-18 часов

УПАКОВКА:
Канистры из пластика, 20 кг.

СРОК ХРАНЕНИЯ:
1 год в закрытой канистре.

Похожее

Противогрибковые препараты против кандидозных инфекций из традиционной китайской медицины

Инфекции, вызываемые Candida albicans , часто резистентные и с высокой заболеваемостью и смертностью, создают тяжелое бремя для общественного здравоохранения, в то время как существующие противогрибковые препараты ограничены и связаны с токсичностью и сопротивление. Сообщается, что многие молекулы растительного происхождения, включая соединения, выделенные из традиционной китайской медицины (ТКМ), обладают противогрибковой активностью через различные мишени, такие как клеточная мембрана, клеточная стенка, митохондрии и факторы вирулентности.Здесь мы рассматриваем недавний прогресс в области соединений против Candida от TCM, а также их противогрибковые механизмы. Учитывая разнообразие мишеней и структур, соединения из TCM могут быть потенциальной библиотекой для разработки противогрибковых препаратов.

1. Введение

Одной из серьезных угроз для здоровья являются инфекции, вызываемые грибковыми патогенами, среди которых Candida являются вторыми по распространенности грибковыми патогенами после Cryptococcus neoformans , вызывающими около 400000 опасных для жизни инфекций в год в во всем мире со смертностью до 40% [1, 2]. Candida spp. составляла 98% фунгемий, связанных с центральным венозным катетером, у онкологических больных [3]. Среди множества видов Candida наиболее распространенным грибковым возбудителем болезней человека является Candida albicans , за которым следуют Candida glabrata , Candida parapsilosis , Candida tropicalis, и Candida krusei [2].

Как основной условно-патогенный грибок, C. albicans в нормальных условиях обитает на коже, в ротовой полости, слизистой оболочке кишечника и урогенитального тракта как симбиотический гриб [4].Хозяин может различать комменсальное и патогенное состояние C. albicans , что делает этот гриб под наблюдением иммунной системы, а бактериальный микроб в местах, где колонизируются C. albicans , также способствует сдерживанию этого грибка [5, 6]. Защита хозяина от C. albicans основана на сложной сети, состоящей из компонентов врожденного и адаптивного иммунитета (например, эпителиальных клеток, макрофагов, нейтрофилов, дендритных клеток, дефенсинов и комплемента).Когда хозяева сталкиваются с пониженными функциями иммунной системы (в результате ВИЧ-инфекции, трансплантации органов и лечения рака [7]) или нарушением баланса микрофлоры из-за использования антибиотиков [8], кожно-слизистыми и поверхностными инфекциями, такими как молочница полости рта и вагинит. , появиться. Этот грибковый патоген также может вызывать опасные для жизни систематические инфекции, такие как кандидемия. К другим предрасполагающим факторам инфекций Candida относятся диабет и пожилой возраст [9]. Среди внутрибольничных инфекций кровотока инфекции, вызванные C.albicans — четвертое место по распространенности [10].

В настоящее время терапевтические препараты для инфекций Candida ограничены пятью классами соединений: полиены, аллиламины, азолы, фторпиримидины и эхинокандины [11], а также амфотерицин B, тербинафин, флуконазол, 5-фторцитозин и каспофунгин. примеры для них [12]. Лекарственная устойчивость возникает из-за повсеместного применения противогрибковых препаратов, таких как флуконазол и вориконазол, как в профилактических, так и в терапевтических целях [13].Клеточные и молекулярные механизмы, лежащие в основе лекарственной устойчивости, могут включать снижение накопления внутриклеточных лекарств из-за повышенного оттока лекарств (например, повышенные уровни мРНК членов суперсемейства ABC-транспортеров), мутации в генах целевого белка (приводящие к повышенным уровням целевого белка или снижению аффинности). к мишеням) и модификации путей метаболизма (таких как измененный путь синтеза стерола, который играет важную роль как в структуре, так и в функции клеточной стенки грибов) [14].Исследования указывают на обширную регуляцию внутриклеточных процессов в ответ на противогрибковые препараты. Фунгистатическое свойство некоторых лекарств, таких как азолы и 5-флуцитозин, также способствует возникновению устойчивости [10], в то время как образование биопленки может способствовать повышению устойчивости [15]. Малочисленность противогрибковых препаратов и появление резистентности делают насущной миссией обнаружение и выявление новых результатов и выводов, связанных с синтезированными химическими веществами или натуральными продуктами. По сравнению с синтезированными химическими веществами, натуральные продукты обладают многими преимуществами, такими как структурное разнообразие и относительно низкая токсичность.

Натуральные продукты представляют собой потенциальный источник противогрибковых препаратов либо в их зарождающейся форме, либо в качестве оригинальных шаблонов для оптимизации структуры для получения более эффективных и безопасных производных [16, 17]. Среди имеющихся на рынке антибиотиков, используемых в клинической практике, около 80% получают из натуральных продуктов [17]. Традиционная китайская медицина состоит в основном из трав, которые использовались на протяжении тысячелетий. Недавно было продемонстрировано, что отдельные соединения, выделенные из многих традиционных китайских трав, обладают различными видами фармакологической активности, такими как антибактериальное, противоопухолевое, противовирусное и противогрибковое действие.Учитывая нынешнюю нехватку противогрибковых препаратов и полезность традиционной китайской медицины, это может быть многообещающей стратегией по разработке противогрибковых средств из традиционных китайских лекарств. Здесь мы кратко рассмотрим новейшие противогрибковые соединения из традиционных китайских лекарств.

2. Соединения, нацеленные на клеточную мембрану

Плазматическая мембрана защищает цитоплазму от окружающей среды. Целостность и текучесть клеточной мембраны важны для выживания и роста грибковых клеток; Одна из важных причин заключается в том, что многие ферменты, каналы и переносчики лекарств находятся на клеточной мембране.Клеточная мембрана — это место, где происходят многие метаболические процессы, и в то же время она создает барьер для стрессов окружающей среды.

Получено из Sambucus williamsii , традиционной травы, широко используемой на протяжении сотен лет для лечения переломов, отеков и царапин в странах Восточной Азии, (-) — olivil-9′- O — β — D-глюкопиранозид проявляет свою противогрибковую активность против C. albicans путем деполяризации клеточной мембраны, о чем свидетельствует приток йодида пропидия (PI) и повышенная флуоресценция йодида 3,3′-дипропилтиакарбоцианина (DiSC ₃ (5), цианиновый краситель для измерения мембранного потенциала) [18].Более важным и обнадеживающим является то, что это соединение проявляет небольшую гемолитическую активность в отношении эритроцитов человека [18]. Два других компонента (оба являются лигнанами) из того же растения, ларицирезинол [19] и (+) — пинорезинол, проявляют аналогичные эффекты против Candida , повреждая плазматическую мембрану, что приводит к пермеабилизации [19, 20]. Различное воздействие на клетки человека и грибов подразумевает, что он может воздействовать на уникальные компоненты клеток грибов, которые требуют дальнейшей идентификации. Другое соединение, выделенное из Sambucus williamsii , глохидиобозид, проявляет противогрибковую активность, аналогичную (-) — оливил-9′- O — β -D-глюкопиранозид против C.albicans , образуя поры на цитоплазматической мембране с радиусом от 1,4 до 2,3 нм [21]. Один из продуктов вторичного метаболизма Trachelospermum asiaticum , дигидродегидродиконифериловый спирт 9′- O — β -D-глюкозид, также может деполяризовать трансмембранный потенциал за счет образования пор с радиусом от 0,74 нм до 1,4. нм [22]. Изменения гранулярности и размера, выявленные с помощью методов проточной цитометрии, также включают изменения свойств мембраны, таких как осмолярность [22].Тем не менее, нет очевидной причинной связи между нарушением мембранного потенциала и изменениями осмолярности, а также нет выводов о том, что является первым, что еще предстоит изучить.

Гликосфинголипидный гликозилцерамид в клеточной оболочке, возможно, представляет собой лучшую мишень для противогрибкового терапевтического лечения, как компонент клеточной мембраны грибов, отличный от параллельной оболочки млекопитающих и критический модулятор для дифференцировки и патогенности грибов [23].

Эргостерин играет важную роль в регулировании текучести клеточной мембраны и клеточного деления клеток грибов, в то время как структурные и конформационные различия между эргостеролом и стеролом (аналог эргостерола в клетках млекопитающих) лежат в основе противогрибкового механизма полиенов, таких как амфотерицин. В [12, 24].Несмотря на низкую биодоступность и высокую токсичность препаратов, нацеленных на эргостерин, для человека [25, 26], эргостерин по-прежнему представляет собой хорошую мишень для противогрибковых препаратов из-за важности клеточной мембраны.

Магнолол, одно из основных фармакологически активных соединений из Magnolia officinalis , которое можно использовать для облегчения таких симптомов, как тревожность, астма, нервное расстройство и проблемы с пищеварением [27], может снизить содержание эргостерола в широко используемом С.albicans SC5314 [28]. Соединения эфирного масла мяты, такие как ментол, ментон и карвон, подавляют рост C. albicans за счет уменьшения содержания эргостерола в клеточной мембране и вызываемого ими гемолиза меньше, чем вызванного флуконазолом [29]. . Уровни эргостерола также можно снизить с помощью карвакрола (выделенного из Origanum dictamnus L .) И тимола, которые могут оказывать свое влияние на систему антиоксидантной защиты, увеличивать проницаемость мембран, блокировать оттокные насосы и, таким образом, восстанавливать противогрибковую чувствительность [ 30, 31].Помимо видов Candida , была выявлена ​​противогрибковая активность этого соединения против других грибов, таких как Monilinia laxa [31–33].

Транспортеры, такие как переносчики ABC на клеточной мембране, могут вызывать отток противогрибковых средств, тем самым снижая эффективность лекарств. Обработка магнололом может значительно уменьшить отток флуконазола, тем самым усиливая противогрибковые эффекты флуконазола [28].

PM-H ⁺ АТФаза на клеточной мембране играет жизненно важную роль в поддержании трансмембранного электрохимического протонного градиента, который важен для получения питательных веществ.Гемостаз межклеточного pH, модулируемый АТФазой PM-H ⁺ , имеет большое физиологическое значение. А ферментативная активность АТФазы PM-H ⁺ положительно коррелирует с жизнеспособностью клеток [29]. Карвон, ментол и ментон могут подавлять активность АТФазы PM-H ⁺ , предположительно первичную причину противогрибковых эффектов [29]. Результаты также указали на существование целей, которые могут быть легко затронуты внешними лекарствами, несмотря на то, что необходимо приложить дополнительные усилия.

3. Соединения, нацеленные на компоненты клеточной стенки

Структурная целостность клеточной стенки жизненно важна для выживания и роста грибковых клеток, поскольку она обеспечивает защиту от осмотического давления и других стрессов в окружающей среде. Недавние исследования показали, что он, вероятно, играет важную роль в колонизации и формировании биопленок C. albicans , поскольку белки, связанные с адгезией, такие как Als1, Als3 и Hwp1, являются белками клеточной стенки [34, 35]. Поврежденная клеточная стенка приводит к осмотической хрупкости грибковой клетки, нарушению мембраны, оттоку цитоплазматического содержимого и подавлению роста грибов [13].В клетках млекопитающих отсутствует клеточная стенка, что делает ее предпочтительной мишенью для потенциальных противогрибковых препаратов по соображениям безопасности. Клеточная стенка видов Candida содержит гликопротеины и большое количество углеводов, среди которых в основном глюкан, манноза и хитин [10]. В следующей части этого обзора мы обсудим противогрибковые компоненты растительного происхождения, действующие на элементы клеточной стенки или на синтез этих элементов.

3.1. Хитин

Как один из основных компонентов, составляющих клеточную стенку грибов, хитин представляет собой длинный линейный гомополимер β -1,4-связанный N -ацетилглюкозамин (GlcNAc) и синтезируется путем включения единиц GlcNAc из предшественник уридин 5′-дифосфо- N -ацетилглюкозамин (UDP-GlcNAc) в реакции, катализируемой хитинсинтетазой (CHS) [36, 37].

Несмотря на небольшой процент в клеточной стенке, хитин играет важную роль в поддержании механической прочности клеточной стенки грибов, тем самым поддерживая целостность клеточной стенки грибов [38]. Повреждение клеточной стенки может быть уменьшено за счет повышенного количества хитина в клеточной стенке из-за повышенного синтеза и / или снижения деградации хитина, что может повысить толерантность к противогрибковым препаратам [38]. Поскольку этого материала нет в клетках человека, он представляет собой привлекательную мишень для противогрибковой терапии [36].Химическая структура классических ингибиторов CHS, а именно полиоксинов и никкомицинов, легко разрушается in vivo и затрудняется прохождение через клеточную мембрану, что приводит к низкой противогрибковой активности [36, 39]. Это побуждает искать новые ингибиторы ХС.

Плагиохин E, полученный из печеночника Marchantia polymorpha L., проявляет свой противогрибковый эффект за счет ингибирования экспрессии гена 1 хитинсинтетазы (CHS1) и, следовательно, подавления активности CHS и последующего синтеза хитина как in vivo, , так и in situ [ 13].Интересно, что экспрессия генов CHS2 и CHS3 повышается под действием этого макроциклического соединения [13]. Однако та же группа обнаружила, что воздействие плагиохина E на C. albicans может вызывать накопление активных форм кислорода (АФК) из-за нарушения работы митохондрий, в то время как предварительная обработка L-цистеином может способствовать выживанию C. albicans [40 ]. Эти исследования показывают, что плагиохин E может проявлять свою противогрибковую активность посредством различных неизвестных в настоящее время механизмов.

3.2. Глюкан

Этот углеводный полимер вместе с хитином является структурным компонентом, который поддерживает целостность и физическую прочность клеточной стенки. Производство и сборка глюкана в C. albicans требует ряда ферментов и регуляторных сетей, которые специфичны для грибов и, таким образом, делают некоторые интересные мишени для противогрибковой терапии [41]. Самыми известными препаратами этого типа являются эхинокандины, такие как каспофунгин и микафунгин, которые ингибируют синтез β -1,3-глюкана [10].Хотя они быстродействующие, менее токсичные и фунгицидные [10], мутации в β -1,3-глюкансинтазе, которые придают устойчивость к каспофунгину, уже появились. Недавно новое терпеновое противогрибковое средство SCY-078 продемонстрировало фунгицидную активность против C. albicans за счет ингибирования глюкансинтазы [42]. Хауттуйфонат натрия, производное Houttuynia cordata Thunb., , может оказывать синергетический эффект с флуконазолом за счет вмешательства в синтез и транспорт β -1,3-глюкана [43].

4. Соединения, нацеленные на митохондрии

Классические дыхательные цепи митохондрий являются центрами производства энергии посредством окислительного фосфорилирования, а митохондрии — это органеллы, которые производят промежуточные продукты метаболизма, используемые для биосинтеза аминокислот и липидов. И энергоснабжение, и метаболиты необходимы для выживания и роста C. albicans , а также для основных клеточных событий, таких как переход от дрожжей к гифам. Митохондрии также участвуют в опосредованной оттоком резистентности C.albicans к флуконазолу [44], тогда как устойчивость in vitro C. glabrata к азолам связана с дефицитом митохондриальной ДНК [45]. Устойчивость к азолу также, вероятно, связана со снижением генерации эндогенных АФК, вредных для ДНК, белков и липидов, в то время как АФК в основном генерируются ферментными комплексами (Комплекс I и Комплекс III) в классической дыхательной цепи в качестве побочных продуктов селективного деградация митохондрий [44]. Повышенные уровни внутриклеточных АФК участвуют в противогрибковых эффектах флуконазола и миконазола, а АФК также играют важную роль во внутреннем митохондриальном пути апоптоза у C.albicans [46, 47]. Помимо обычных ферментов классической дыхательной цепи в клетках C. albicans существуют также нечувствительная к ротенону НАД (Ф) Н дегидрогеназа и альтернативные терминальные оксидазы, составляющие нечувствительную к цианиду дыхательную цепь [48–50]. Кроме того, у C. albicans и C. parapsilosis есть дополнительный дыхательный путь, называемый параллельной дыхательной цепью [51]. Различия между митохондриальными ферментами грибов и млекопитающих также делают возможной разработку лекарств, нацеленных на эти ферменты [52].Это случай некоторых агрохимикатов, таких как боскалид и карбоксин, которые ингибируют сукцинатдегидрогеназу в клетках грибов [53]. Хотя существует лишь несколько исследований лекарств, нацеленных конкретно на митохондрии Candida spp . , ME1111 [2- (3,5-диметил-1 H -пиразол-1-ил) -5-метилфенол] действительно оказывал противогрибковое действие на патогены человека Trichophyton mentagrophytes и Trichophyton rubrum путем ингибирования сукцината в митохондриях с высокой селективностью (значения IC ₅₀ для клеток человека более чем в 30 раз выше, чем для клеток грибов) [53].Одним словом, митохондрии могут быть многообещающей мишенью для противогрибковой терапии.

Являясь важным компонентом многих трав семейства Berberidaceae, таких как Berberis vulgaris , берберин оказывает противогрибковое действие за счет индукции митохондриальной дисфункции и увеличения образования ROS, и его эффекты находятся в синергии с флуконазолом, даже в клинических изолятах, устойчивых к флуконазолу. [54–56]. Более того, обработка берберином также может привести к нарушению целостности клеточной стенки у C.albicans [57] и подавляют сверхэкспрессию гена устойчивости к лекарствам CDR1, индуцированную флуфеназином [58]. Хотя берберин может вызывать апоптоз во многих клетках человека, таких как лейкозные клетки HL-60 и клетки карциномы щитовидной железы [59, 60], берберин может восстанавливать митохондриальную функцию, вызванную кормлением с высоким содержанием жиров на модели крыс, и может снижать накопление триглицеридов в клетках. печень мышей [61, 62]. Это также заметно снизило генерацию АФК в митохондриях [62]. Это делает берберин хорошим кандидатом для противогрибкового развития, хотя еще многое предстоит сделать.

(+) — Медиорезинол из противовоспалительного, болеутоляющего и мочегонного растения Sambucus williamsii , примененный к C. albicans, может вызывать образование ROS и остановку клеточного цикла и, наконец, апоптоз [47]. Хотя (+) — медиорезинол может ингибировать in vitro , пролиферацию клеток млекопитающих, таких как клетки A549, SK-MEL-2, SK-OV-3 и HCT-15, при высоких концентрациях, значения IC ₅₀ для этих линии клеток были намного выше, чем значение MIC против C.albicans [47, 63]. В когортном исследовании, проведенном в Швеции, (+) — медиорезинол в пище явно не снижал риск рака пищевода и желудка, но, по крайней мере, это соединение в рационе не оказывало отрицательного воздействия [64, 65]. Безопасный профиль этого лигнина делает его более вдохновляющим, хотя нет сообщений о его влиянии на митохондрии млекопитающих.

Аллиловый спирт из чеснока (Allium sativum), , который использовался в качестве традиционного противомикробного средства в течение тысяч лет, оказывает противогрибковое действие за счет введения окислительного стресса, такого как увеличение производства ROS и истощение глутатиона.Известными мишенями аллилового спирта являются цитозольные алкогольдегидрогеназы Adh2 и Adh3 и митохондриальные Adh4 [66]. Хотя аллиловый спирт может выделяться после приема чеснока, его токсичность, опосредованная акролеином, выработка которого у грызунов катализируется алкогольдегидрогеназой, препятствует его развитию в качестве противогрибкового агента [66, 67].

Байкалин может ингибировать активность ферментов в митохондриях (таких как Ca ²⁺ -Mg ²⁺ -АТФаза, сукцинатдегидрогеназа и цитохромоксидаза) и вызывать блокировку клеточного цикла и апоптоз при C.albicans [68]. Однако в клетках млекопитающих (например, в клетках СНО) байкалин может снижать продукцию АФК [69]. Имеются также сообщения, показывающие, что байкалин индуцирует апоптоз в клетках немелкоклеточного рака легких и клетках остеосаркомы человека за счет продукции АФК [70, 71]. Байкалин может защищать митохондрии от повреждений, вызванных стрептозотоцином и ишемией / реперфузией печени, а также повышать активность цитратсинтазы у крыс [72, 73]. Несмотря на несоответствие ролей байкалина в различных клетках в продукции АФК, тесты in vivo могут подтвердить использование байкалина в качестве противогрибкового кандидата [69, 71, 73].

Шиконин, основное активное соединение, выделенное из Lithospermum erythrorhizon , может индуцировать выработку эндогенных АФК, снижать потенциал митохондриальной мембраны и изменять аэробную аспирацию митохондрий [74]. В клетках рака желудка человека и медуллярных клетках карциномы щитовидной железы ТТ шиконин также может индуцировать продукцию АФК и митохондриально-опосредованный апоптоз [75, 76]. Почти такая же цитотоксичность для грибковых клеток и клеток млекопитающих делает шиконин менее привлекательным кандидатом для противогрибковых разработок.

Куркумин, желтый пигмент, выделенный из куркумы (корневище растения Curcuma longa Linn ), также можно использовать в качестве дополнительного лекарственного средства для лечения патогенных микроорганизмов, таких как Helicobacter pylori , метициллин-устойчивый Staphylococcus ( MRSA) и Trypanosoma cruzi . Противогрибковая активность против различных видов грибов, таких как Candida видов, Cryptococcus neoformans , Aspergillus spp., и Sporothrix schenckii также были продемонстрированы этим соединением [77, 78] . Куркумин может увеличивать продукцию АФК и апоптоз в клетках C. albicans , либо отдельно, либо в сочетании с противогрибковыми препаратами, такими как азолы и полиены [78, 79]. В клетках млекопитающих куркумин может защищать митохондрии от повреждений и увеличивать биогенез митохондрий, хотя также сообщалось о влиянии куркумина на апоптоз в раковых клетках [80, 81]. Что наиболее важно, это соединение может быть безопасным при максимальной переносимой дозе 12000 мг / день в клинических испытаниях фазы I [82], что дает преимущество перед другими противогрибковыми соединениями.Однако низкая биодоступность при пероральном приеме и плохая растворимость в водных растворах препятствуют его использованию и способствуют развитию методов доставки куркумина для борьбы с инфекциями Candida [83].

Силибинин, наиболее известное и активное соединение, выделенное из Silybum marianum (расторопша), традиционно используемого для защиты от повреждения печени, может вызывать апоптоз, связанный с притоком митохондриального Ca ²⁺ в клетках C. albicans [84, 85]. Силибинин может облегчить митохондриальную дисфункцию у мышей, моделирующих острое повреждение почек, индуцированное цисплатином, посредством активации Sirt3, хотя также сообщалось о in vitro проапоптотических эффектах за счет индукции продукции ROS [86, 87].Безопасный профиль силибинина, подтвержденный продаваемыми продуктами здорового питания и клиническими испытаниями, делает силибинин очень многообещающим кандидатом для противогрибковой терапии против инфекций Candida , хотя предстоит еще долгий путь [88].

5. Факторы вирулентности

Факторы вирулентности, способствующие инфицированию Candida , содержат адгезины, ферменты вирулентности (секретируемые аспартил протеиназы и фосфолипазы, функционирующие при инвазии тканей хозяина) [89] и морфологический переход [90].

5.1. Переход дрожжей в гифы

Хотя в очагах инфекций были обнаружены как почкующиеся дрожжи, так и тип гиф у C. albicans , переход дрожжей в гиф у C. albicans рассматривается как главный фактор, вовлеченный в колонизацию, инвазию / проникновение, вирулентность, уклонение от иммунитета и выживание в тканях хозяина [91–93]. Например, большая часть роста гиф C. albicans не могла быть подавлена ​​макрофагами после поглощения in vitro , и также наблюдался лизис макрофагов, вызванный проникновением гифы [94].Стоит упомянуть, что вскоре после фагоцитоза макрофагами необходимо (но не достаточно) образование гиф C. albicans для индукции провоспалительного пироптоза, своего рода запрограммированной гибели клеток макрофагов, опосредованной инфламмасомой, раньше других макрофагов. гибнут крепкими гифами C. albicans [95–97]. Хотя недавно идентифицированный кандидализин, секретируемый гифами C. albicans, играет жизненно важную роль в патогенезе слизистой оболочки благодаря своим цитолитическим эффектам, сообщений о связи между ним и повреждением макрофагов опубликовано не было [98].Тем не менее, кандидализин является многообещающей противогрибковой мишенью для C. albicans . Более того, гифы также могут поддерживать сложные характерные структуры зрелых биопленок, которые будут обсуждаться позже [99]. Вызванный экзогенными стрессорами (такими как наличие сыворотки и изменения температуры, pH, уровня кислорода и глюкозы [91], присутствие N -ацетил- D -глюкозамина (GlcNAc) [100], приверженность и голодание / ограничение питательных веществ [92]), филаментация C.albicans включает лежащие в основе изменения в синтезе белка и метаболические изменения, которые в основном относятся к пути RAS1-Cyr1p-cAMP-PKA-EFG1 и передаче сигналов митоген-активируемой протеинкиназы (MAPK) [91, 92]. Оба сигнальных пути регулируются интегрированной в мембрану малой GTPase Ras1 [101].

Магнолол и гонокиол, два вида неолигнана, выделенные из корня, стебля и коры ветвей Magnolia officinalis , могут ингибировать переход дрожжей в гифу C. albicans во многих условиях культивирования.Обработка магнололом или гонокиолом может вызвать подавление компонентов пути Ras1-cAMP-Efg1 (таких как RAS1, EFG1, TEC1 и CDC35 (ортолог Cyr1)), а также снижение уровней экспрессии гиф-специфичных генов ECE1. , HWP1 и ALS3, в то время как экзогенный цАМФ может восстанавливать рост нитей в присутствии препаратов. Это предполагает, что эффекты ингибирования переходов этих двух соединений могут быть связаны с подавлением пути Ras1-cAMP-EFG1 [102]. Куркумин также может ингибировать переход дрожжей в гифы, воздействуя на супрессор транскрипции TUP1 (поглощение тимидина 1) [79].Ликохалкон-А, биоактивный полифенол из корней солодки, который использовался в качестве лечебного средства на протяжении сотен лет, может ингибировать морфологический переход [103]. Соединение глабридин из солодки и антрахинон пурпурин из корня марены ( Rubia tinctorum L.) также могут ингибировать переход [104, 105].

Помимо регулирующей роли в противогрибковой устойчивости у планктонных C. albicans , шаперон Hsp90 также может модулировать переход, ингибируя филаментацию посредством передачи сигналов цАМФ-PKA [106].Делеция Hsp90 в C. albicans приводит к вирулентному ослаблению на модели системного кандидоза [107]. Так появилась гипотеза, что ингибиторы Hsp90 могут проявлять эффекты против Candida .

5.2. Образование биопленок

Большинство инфекций, вызываемых Candida spp. включают биопленки, образующиеся на поверхности биоматериалов (таких как внутрисосудистые катетеры и протезы сердечных клапанов) и биотической слизистой оболочке (например, в полости рта и на поверхности раны) [108]. Биопленка, погребенная во внеклеточном матриксе (ВКМ), имеет сложную трехмерную архитектуру, состоящую в основном из клеток дрожжевой формы и клеток гиф с большой неоднородностью в пространстве [15, 109].Считается, что пространственная, структурная и метаболическая неоднородность биопленок способствует притоку питательных веществ, оттоку продуктов жизнедеятельности и образованию микроничек, что облегчает адаптацию биопленок к гипоксической среде [99, 110]. Начиная с прикрепления грибковых клеток к поверхности субстрата, развитие биопленки подвергается пролиферации, созреванию и, наконец, диссеминации, чтобы завершить цикл, и цикл может повторяться, чтобы увеличить популяцию грибов [15].Клетки в биопленке демонстрируют большие преимущества по сравнению со свободно живущими аналогами в выживании, такие как повышенная устойчивость ко многим антимикотическим препаратам (например, клеток биопленки C. albicans почти в 1000 раз устойчивы к флуконазолу, чем свободноживущие клетки [111]). и защита, предлагаемая ECM [15]. Повышенная устойчивость к антимикотическим препаратам и способность противостоять иммунной защите хозяина, а также роль резервуара для продолжающихся инфекций биопленок Candida вызывают важные клинические последствия, а присутствие биопленок увеличивает заболеваемость и смертность на C.albicans по сравнению со штаммами, не способными образовывать биопленки [99, 112]. Поэтому образование биопленок считается мощным фактором вирулентности [34]. В настоящее время биопленки Candida привлекают все больше и больше внимания, что может отражаться увеличением количества публикаций о биопленках Candida .

Белки теплового шока играют ключевую роль в защите клеток от повреждений и восстановлении повреждений, вызванных повреждениями, а также в синтезе, фолдинге, транспорте и мембранной транслокации и т. Д. [9].Нарушение функции Hsp90 в C. albicans с помощью генетических манипуляций или фармакологических средств может уменьшить распространение и созревание биопленок, а также повысить чувствительность к лекарствам, используемым для уничтожения биопленок [106]. Таким образом, ингибиторы Hsp90 могут представлять собой полезную парадигму для терапии инфекций, вызванных биопленкой.

В клетках биопленок Candida была обнаружена повышенная экспрессия многих генов, таких как гены, участвующие в синтезе белка, транспортировке лекарств, прикреплении к матрице и первичном метаболизме [109].Гены, кодирующие белки оболочки, такие как Hwp1, Als1, Als3 и Sun41, играют критическую роль в формировании биопленок [92].

Хотя структуры биопленки C. albicans могут быть разрушены физическими средствами, такими как механическое удаление щеткой по поверхности зубов и обработка имплантатов ультразвуком (или ультразвуком) [113], удаление C. albicans в первую очередь зависит от лекарств, которые могут предотвратить образование биопленки или уничтожить созревшую биопленку.

Образование биопленок Candida spp.и другие грибы могут быть реплицированы в 96-луночных микротитрационных планшетах [36], а также в парадигмах животных [15], которые предоставляют нам полезные инструменты для скрининга потенциальных противогрибковых попаданий. Масло корицы, полученное из Cinnamomum zeylanicum , проявляет противогрибковую активность против C. orthopsilosis и C. parapsilosis , подавляя образование биопленок, а также рост планктонных аналогов [114], хотя точный механизм неизвестен. Один из основных компонентов коричный альдегид (масла) может также ингибировать образование биопленок клинических изолятов C.albicans [115], и, кроме того, он может подавлять рост Aspergillus flavus и Aspergillus oryzae , которые являются виновниками порчи пищевых продуктов [116]. Берберин, алкалоид из лекарственных растений, таких как Coptis chinensis и Hydrastis canadensis, , также оказывает противогрибковое действие против биопленок C. albicans , как отдельно, так и в сочетании с миконазолом [117]. Ликохалкон-А также продемонстрировал противогрибковую активность in vitro и in vivo против C.albicans биопленок [103]. Пурпурин также продемонстрировал противогрибковую активность против образования и преформированных биопленок C. albicans в дополнение к его способности ингибировать морфологический переход [104].

Помимо ингибирования перехода дрожжей в гифу, магнолол и хонокиол также ингибируют образование биопленок за счет подавления адгезии и роста C. albicans , что подтверждается анализом XTT и конфокальной лазерной сканирующей микроскопией. Эти два соединения могут снижать грибковую нагрузку и увеличивать продолжительность жизни Caenorhabditis elegans в модели инфекции нематод [102].Что еще более важно, соединения в используемых концентрациях не оказывают вредного воздействия на клетки HSC-T6 и нематод млекопитающих [102]. Куркумин также может ингибировать образование биопленок у C. albicans [118]. Тимол (5-метил-2- (1-метилэтил) фенол), основное эфирное масло травы тимьяна ( Thymus vulgaris L., Lamiaceae), которое можно применять для лечения множества симптомов, включая бронхит, коклюш и катар. верхних дыхательных путей [119, 120], проявляет противогрибковую активность в отношении флуконазол-чувствительных и флуконазолустойчивых изолятов C.albicans [121]. Недавнее исследование показало, что тимол может ингибировать образование и развитие биопленок, и, кроме того, это соединение может усиливать антимикробные реакции хозяина против C. albicans и увеличивать продолжительность жизни C. elegans во время грибковой инфекции [115, 122]. Кроме того, тимол проявил синергизм с флуконазолом против биопленок [115, 123]. Байкалеин и аукубин из Plantago major (подорожник большой), многолетнее растение, используемое для заживления ран, обезболивающее, противовоспалительное, антиоксидантное и инфекционное, могут ингибировать образование биопленок и снижать гидрофобность клеточной поверхности до C.albicans [124]. Эвгенол, основной компонент эфирных масел из Syzygium aromaticum (гвоздика), обладает способностью подавлять образование биопленок и предварительно сформированных биопленок, что более эффективно, чем имеющееся на рынке противогрибковое лекарственное средство флуконазол. Это соединение может также оказывать синергетический эффект с флуконазолом [115, 123], и, более того, анализируется взаимосвязь структура-активность этого соединения [125]. Другой фенилпропаноид гвоздики, метилэвгенол, также проявляет противогрибковый эффект против устойчивых к флуконазолу изолятов Candida и синергетический эффект с флуконазолом [126].Также была выявлена ​​антибиотикопленочная активность ментола из мяты, как отдельно, так и в комбинации с флуконазолом [123, 127]. Так обстоит дело с гераниолом (3,7-диметилокта- транс -2,6-диен-1-ол) [115], ациклическим монотерпеновым спиртом, который можно выделить из многих трав, таких как Pelargonium graveolens (Geraniaceae ), мускатный орех и имбирь [128, 129]. Другое соединение из Pelargonium graveolens, линалоол, также оказывает противогрибковое действие на планктонные и биопленочные клетки C.tropicalis [129]. Карвакрол может также сенсибилизировать биопленок Candida , а также планктонные клетки к флуконазолу [130]. Усниновая кислота (2,6-диацетил-7,9-дигидрокси-8,9b-диметил-1,3 (2H, 9bH) -дибензофурандион), основной активный компонент, выделенный из медицинских лишайников, таких как Cladonia и . Usnea [131], может ингибировать образование биопленок Candida и других вирулентных признаков [132, 133]. Берберин из Berberis aquifolium, Hydrastis canadensis, Phellodendron amurense обладает противогрибковой активностью против флуконазол-резистентных Candida spp.в виде планктона и биопленок [134]. Эмодин из корневищ Rheum palmatum может ингибировать образование биопленок и развитие гифов C. albicans [135].

5.3. Другие факторы

Вирулентность у мышей, вызванная мутантами C. albicans , дефицитными по изоцитратлиазе 1 (ICL1, основной компонент глиоксилатного цикла), очевидно, меньше, чем у эквивалентов широкого типа, что указывает на участие глиоксилатного цикла в патогенез кандидоза [136].ICL1, как и малатсинтаза, является отличительным ферментом, который не наблюдался в клетках млекопитающих; таким образом, он может стать уникальной мишенью для подавления вирулентности C. albicans для борьбы с этим грибковым патогеном. Недавно ингибиторы малатсинтазы продемонстрировали противогрибковый эффект против Paracoccidioides разновидностей [137], в то время как апигенин, активное флавоновое соединение в китайских травах, таких как тимьян, может ингибировать ферментативную активность ICL1 в C. albicans [138, 139] .Розмариновая кислота, биоактивный полифенол в травах, таких как базилик (Ocimum basilicum) , душица (Origanum vulgare) , шалфей (Salvia officinalis), и Melissa officinalis , также был идентифицирован как ингибитор ICL1. C. albicans [138, 140]. Недавнее исследование Ansari et al. продемонстрировали, что как ферментативная активность, так и экспрессия мРНК ICL1 и малатсинтазы C. albicans могут ингибироваться монотерпеноидом периллиловым спиртом, активным веществом пищевого и лекарственного растения Perilla frutescens L.ex B. D. Jacks. (Lamiaceae), который использовался для лечения простуды, пищевой аллергии и депрессии [141, 142]. Принимая во внимание отсутствие ICL1 у человека, хорошо переносимый профиль у человека и тот факт, что испытания фазы II были проведены у больных раком, периллиловый спирт может служить интересным кандидатом для противогрибковой терапии против C. albicans [143] , 144].

Подобно Pseudomonas aeruginosa , коммуникация между грибковыми клетками часто связана с вирулентностью [145].Определение кворума означает, что молекулы, секретируемые клетками C. albicans в ответ на плотность клеток, могут влиять на поведение клеток. Формирование биопленок, факторов роста гиф и вирулентности у C. albicans также может регулироваться с помощью определения кворума [146]. Самая известная молекула, воспринимающая кворум C. albicans , — это фарнезол, один ауторегулирующий сесквитерпеновый спирт, который может предотвращать филаментацию (путем репрессии сигнального пути Ras1-cAMP-PKA [147]), сокращать биопленку (если она добавляется до прикрепления или после образования, но не на начальных стадиях роста биопленок [148]), и блокируют другие факторы вирулентности [149].Так появилась стратегия, согласно которой нацеливание на молекулы, чувствительные к кворуму, может способствовать противогрибковой терапии [146]. Действительно, пищевой флавоноид кверцетин, выделенный из пищевого и лекарственного лишайника Usnea longissimi , может сенсибилизировать устойчивый к флуконазолу изолят NBC099 к флуконазолу, и такой вид сенсибилизации может быть вызван кверцетином выработкой фарнезола [146].

Другая молекула, воспринимающая кворум, продуцируемая C. albicans , тирозол, также может влиять на развитие биопленок Candida [150].Этот ароматический спирт может вызвать морфологический переход от дрожжей к гифам. В высоких концентрациях (более 200 мМ) тирозол может вызвать сокращение биопленок, образованных видами Candida , а также Streptococcus mutans [151].

Внеклеточные гидролитические ферменты, продуцируемые C. albicans , считаются факторами вирулентности, ответственными за проникновение и повреждение клеток-хозяев, вызываемые этим патогенным грибком [152]. Эти ферменты включают секретируемые аспарагиновые протеиназы, липазы и гемолизины [34].Кверцетин может ингибировать активность протеиназы, эстеразы, фосфолипазы и гемолизинов флуконазол-устойчивого штамма C. albicans NBC099 [146]. Кроме того, это соединение может также взаимодействовать с флуконазолом против биопленок как in vivo , так и in vitro [153].

6. Соединения без идентифицированного механизма

Анофиновая кислота и фоманноксиновая кислота, выделенные из Gentiana Algida , показали слабую противогрибковую активность против C.albicans , в то время как этерификация путем введения метильной группы в эти соединения может усилить активность против Candida , но снизить активность против Cladosporium cucumerinum , который является разновидностью патогенного грибка для растений [154]. Однако с тех пор никаких дальнейших исследований противогрибкового механизма не проводилось. Анофиновую кислоту также можно выделить из другого традиционного китайского лекарства, Gentiana macrophylla , которое долгое время использовалось для лечения запоров, болей, желтухи и ревматизма [155].Другой дигидрофлавон, выделенный из Gentiana macrophylla , кураринон, также может ингибировать рост C. albicans [155]. Нясол ((Z) -1,3-бис (4-гидроксифенил) -1,4-пентадиен), выделенный из травяного растения Anemarrhena asphodeloides Bunge (Liliaceae), который использовался в традиционной китайской медицине как жаропонижающее, противовоспалительное средство. противовоспалительное, противодиабетическое и антидепрессантное средство [156], проявляет противогрибковую активность против C. albicans отдельно или в синергии с азолами [157, 158].Это соединение также обладает активностью против других грибковых патогенов, таких как A. flavus , Fusarium oxysporum , Pythium ultimum, и Rhizoctonia solani , и это лишь некоторые из них [158, 159]. Другое соединение гвоздики, изоэвгенол, также проявило противогрибковую активность против C. albicans , а также Aspergillus niger [125]. α -Терпинеол (2- (4-метил-1-циклогекс-3-енил) пропан-2-ол), из Artemisia annua , может ингибировать серию из видов Candida , выделенных у пациентов с зубным стоматитом [160].Сесквитерпеновый лактон, выделенный из Inula racemosa , показал хорошую противогрибковую активность против видов Candida , а также других грибковых патогенов человека, таких как A. flavus и Geotrichum Candida [161].

7. Заключение

Таким образом, многие природные соединения из TCM могут проявлять свою активность против Candida посредством различных механизмов, обеспечивая большой резервуар для разработки противогрибковых методов лечения.

Комбинированная терапия способна повысить эффективность и предотвратить появление лекарственной устойчивости, и было принято много подходов для определения эффективных комбинаций, особенно синергетических эффектов с имеющимися на рынке лекарствами [162–164].Важная часть адъювантов к антибиотикам может происходить из ранее недооцененной части химических соединений, которые недавно были названы темным химическим веществом (DCM) [165]. Поскольку эти DCM показали низкую биологическую активность или ее отсутствие в предыдущих исследованиях по отношению к человеческим целям, они могут представлять собой новый и ценный репертуар для выявления попаданий и оптимизации потенциальных клиентов [165]. Прогноз синергизма на основе машинного обучения может быть многообещающим методом для выявления синергических эффектов продаваемых противогрибковых препаратов и натуральных продуктов, выделенных из традиционной китайской медицины [162].Принимая во внимание новые белки или биологические процессы, которые могут быть использованы в качестве новых мишеней, таких как гистондеацетилаза и ионный гомеостаз, соединения из TCM могут играть все более важную и разнообразную роль в разработке противогрибковой терапии против C. albicans .

Конфликт интересов

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов в отношении публикации этой статьи.

Идентификация новых противогрибковых соединений, дестабилизирующих клеточную стенку, с использованием условного мутанта протеинкиназы C Aspergillus nidulans | Журнал антимикробной химиотерапии

Аннотация

Цели

Несмотря на потребность в новых лекарствах для борьбы с грибковыми инфекциями, открытие противогрибковых лекарств в настоящее время ограничено как доступностью подходящих мишеней для лекарств, так и анализами для скрининга соответствующих мишеней.Целью этого исследования был скрининг библиотеки небольших химических соединений для идентификации ингибиторов клеточной стенки с использованием условного штамма Aspergillus nidulans , экспрессирующего протеинкиназу C (PKC). Этот мутант специфически чувствителен к соединениям, повреждающим клеточную стенку, в условиях репрессивного роста PKC.

Методы

Ингибирующий эффект библиотеки малых химических соединений был исследован in vitro с использованием условного штамма PKC A. nidulans и панели изолятов патогенных грибов.Микроскопия использовалась для оценки изменений ультраструктуры грибка после лечения.

Результаты

Три «хитовых» соединения, влияющих на целостность клеточной стенки, были идентифицированы из 5000 небольших химических соединений. Наиболее сильнодействующее соединение, CW-11, было дополнительно охарактеризовано, и было показано, что оно специфически влияет на целостность клеточной стенки. В клинических изолятах Aspergillus fumigatus CW-11 вызывает морфологические изменения, характерные для повреждения клеточной стенки, включая утолщение и разрыв стенки.Анализ чувствительности мутантов клеточной стенки и сигнального пути A. fumigatus и A. nidulans к CW-11 позволяет предположить, что его механизм действия отличается от действия противогрибковых препаратов каспофунгина и вориконазола.

Выводы

Эта работа демонстрирует возможность использования условного мутанта Aspergillus для проведения скрининга библиотеки малых молекул для выявления новых «хитовых» соединений, влияющих на целостность клеточной стенки.

Введение

Есть неудовлетворенные потребности в эффективном лечении и профилактике грибковых инфекций.Число опасных для жизни инвазивных грибковых инфекций резко возросло за последние 20 лет. ^1,2 Подавляющее большинство этих инфекций вызываются видами Candida , Aspergillus , Cryptococcus и Coccidioides . ³ Сегодня 4% всех пациентов, умирающих в современных больницах третичного уровня, страдают инвазивным аспергиллезом, тогда как 2% пациентов страдают инвазивным кандидозом. ^2,4

Лечение инвазивных грибковых инфекций остается сложной задачей.Существует четыре основных класса противогрибковых препаратов, широко используемых в клинической практике: полиены (например, амфотерицин B), азолы (например, флуконазол, итраконазол, вориконазол и позаконазол), недавно появившиеся эхинокандины (например, каспофунгин) и аллиламины (например, тербинафин). Из них только первые три класса используются для лечения системных грибковых инфекций. Несмотря на 40% ежегодный рост продаж системных противогрибковых препаратов (2002–07) до примерно 5 миллиардов долларов в год, на этом рынке существуют значительные неудовлетворенные потребности. ⁵ Некоторые современные методы лечения неблагоприятно взаимодействуют с другими лекарствами, имеют проблемы с резистентностью, имеют узкий спектр действия, ограниченный состав, являются фунгистатическими в отличие от фунгицидных, а некоторые токсичны. ⁶ Это в первую очередь потому, что грибы являются эукариотами и поэтому имеют много общих биохимических путей и субклеточных структур с клетками млекопитающих. Следовательно, большинство существующих противогрибковых средств не являются действительно специфичными для грибка. Только один новый класс противогрибковых средств, эхинокандины, ингибирует специфичную для грибов мишень, глюкансинтазу, которая полимеризует β (1,3) глюкан — основной структурный компонент клеточной стенки грибов. ⁷ Действительно, эхинокандины демонстрируют превосходный профиль безопасности и клиническую эффективность. Однако, будучи относительно большими, их нельзя вводить per os . Кроме того, они демонстрируют плохо изученное ослабление активности при более высоких концентрациях. ⁷ Следовательно, существует острая необходимость в разработке дополнительных и новых противогрибковых препаратов, которые подавляют специфические для грибов мишени, такие как клеточная стенка.

В грибах протеинкиназа C (PKC) является центральным ферментом, участвующим в регуляции целостности клеточной стенки.Снижение активности PKC приводит к повышенной чувствительности к соединениям и лекарствам, дестабилизирующим клеточную стенку. ⁸ Мы недавно создали мутант Aspergillus nidulans ( alcA-PKC ), в котором ген PKC регулируется индуцибельным промотором alcA . ⁹ При выращивании в депрессивных условиях (в присутствии глицерина или этанола) мутант растет нормально. Однако в репрессивных условиях (в присутствии глюкозы) мутант проявляет повышенную чувствительность к агентам, нарушающим клеточную стенку, Congo Red и Calcofluor White (CFW), каспофунгину, действующему на основе эхинокандина, и ингибитору PKC стауроспорину.Важно отметить, что штамм alcA-PKC не проявляет повышенной чувствительности к противогрибковым препаратам амфотерицину B, который связывает эргостерин и разрушает плазматическую мембрану грибов, или вориконазолу, ингибитору биосинтеза эргостерола, что позволяет предположить, что этот штамм специфически чувствителен к клеточной стенке. повреждающие агенты. ⁹

Мы воспользовались штаммом alcA-PKC для скрининга 5000 молекул, подобных лекарственным средствам, из разнообразной библиотеки химических соединений низкомолекулярных соединений (Chemical Diversity Inc., Сан-Диего, Калифорния, США) для идентификации ингибиторов клеточной стенки. Эта библиотека ранее успешно использовалась для идентификации ингибиторов МАР-киназы в дрожжах. ¹⁰ Во-первых, мы идентифицировали соединения, которые ингибируют рост A. nidulans дикого типа в 96-луночном жидкостном анализе. Затем полученные противогрибковые соединения тестировали на их влияние на рост мутанта alcA-PKC в депрессивных и репрессивных условиях. Мутант проявлял повышенную чувствительность к трем активным соединениям клеточной стенки в репрессивных условиях.Селективность и способ действия наиболее сильнодействующего и специфического соединения, CW-11, были дополнительно исследованы. Мы предполагаем, что этот подход будет полезен для крупномасштабного скрининга активных соединений клеточной стенки.

Материалы и методы

Штаммы и приготовление посевного материала

Штаммы, использованные в этом исследовании, подробно описаны в таблице 1. Конидии собирали в 0,2% (об. / Об.) Tween 80, ресуспендировали в бидистиллированной воде (DDW) и подсчитывали с помощью гемоцитометра.Штаммы выращивали в минимальной среде (MM), содержащей 70 мМ NaNO ₃ , 1% (мас. / Об.) Глюкозы, 12 мМ фосфата калия, pH 6,8, 4 мМ MgSO ₄ , 7 мМ KCl, микроэлементы и 1,5% ( w / v) агар (для чашек с агаром MM). Минимальную среду с глицерином (MMG), содержащую 0,2% (мас. / Об.) Глицерина вместо глюкозы, использовали для роста штамма alcA-PKC в условиях депрессии.

Таблица 1 Штаммы

, использованные в этом исследовании

пациент дикий тип66 (изолят пациента) (изолят пациента)66 штамм № 1 wild66 (изолят пациента) . Segal

Штаммы .	Генотип .	Арт. .	Источник .
A. nidulans штамм R153	wA2; pyroA4		FGSC
A. nidulans штамм GR-5	wA3; pyrG89 ; pyroA4		G.S. May
A. nidulans штамм alcA-PKC	wA2; pyroA4; pyrG89 :: pyr4 alcA (p) :: pkcAΔp	9	наша лаборатория.
A. fumigatus AF293 / FGSC A1100	дикий тип (изолят пациента)	17	FGSC
A. fumigatus штамм № 1	штамм		I. Шалит
A. fumigatus штамм № 2	дикий тип (изолят пациента)	18	I. изолировать)	18	I.Шалит
Штамм A. niger № 2	дикий тип (изолят пациента)	18	I. Шалит
Штамм A. niger № 3	дикий тип (изолят пациента)	18	I. Shalit
Aspergillus flavus штамм № 1	дикий тип (изолят пациента)	18	I. Shalit
A. flavus 2 штамм дикого типа	18	I.Шалит
A. flavus штамм № 3	дикий тип (изолят пациента)	18	I. Шалит
A. flavus штамм № 4	дикий тип	18	I. Shalit
штамм Aspergillus terreus № 1	дикий тип (изолят пациента)	18	I. Shalit
A. terreus 2	18	I.Шалит
Fusarium solani 603251	дикий тип (изолят пациента)	19	I. .Шалит
F. solani 600679	дикий тип (изолят пациента)	19	I. Я.Шалит
F. oxysporum 600711	дикий тип (изолят пациента)	19	И. Шалит
F. oxysporum 601761	906 дикий тип 906 пациент I. Shalit
Rhizopus arrhizus 156	дикий тип (изолят пациента)		I. Shalit
C. albicans ATCC 2901	дикий тип	пациент	Э.Segal
C. albicans ATCC	дикий тип (изолят пациента)		E. Segal
C. albicans 58455	дикий тип (изолят пациента	E
C. albicans 89122	дикий тип (изолят пациента)		E. Segal
ΔAfuEcm33	AF293.1: Δecm :: pyr4; ΔpyrG	20	наша лаборатория.
ΔPmt1	CEA17 Δpmt1 :: pyrG; ΔpyrG	21	C. Jin
ΔCnaA	AF293.1: ΔcnaA :: pyrG; ΔpyrG	22, 23	W. Steinbach
ATCC 13073	TRB-чувствительный A. fumigatus штамм	24	D.S. Perlin
S678Y	FKS-S678Y	24	D.S. Perlin
ΔPkaA	pabaA A, pabaA ΔargB :: trpC ; trpC801, veA1	25	N.P. Келлер
ΔMpkA	pyrG89 ; ΔmpkA :: pyrG	26, 27	S. Osmani
ΔNikA	pabaA1 yA2 ΔnikA :: AfpyrG veA1	28 90 J.Агирре
ΔCalI11	calI11; gmtA :: NcPyr4; pyrG89; wA3; pyroA4	29	T.W. Хилл
ΔSwoA1	swoA1; pyrG89; wA3; veA1	30	М. Момани
ΔSwoM	swoM1; pyrG89; pabaA6; veA1	31	M. Momany
A. fumigatus G10 (CBS 144–89)	niiA	33	J.P. Latge
ΔchsG	chsG; Ble (фосфотрансфераза флеомицин B)	32	E. Mellado
ΔAgs1	ags1; Hph (фосфотрансфераза гигромицин B)	33	J.P. Latge
ΔGel2	gel2; Ble	34	J.P. Latge

пациент дикий тип66 (изолят пациента) (изолят пациента)66 штамм № 1 wild66 (изолят пациента) . Segal

Штаммы .	Генотип .	Арт. .	Источник .
A. nidulans штамм R153	wA2; pyroA4		FGSC
A. nidulans штамм GR-5	wA3; pyrG89 ; pyroA4		G.S. May
A. nidulans штамм alcA-PKC	wA2; pyroA4; pyrG89 :: pyr4 alcA (p) :: pkcAΔp	9	наша лаборатория.
A. fumigatus AF293 / FGSC A1100	дикий тип (изолят пациента)	17	FGSC
A. fumigatus штамм № 1	штамм		I. Шалит
A. fumigatus штамм № 2	дикий тип (изолят пациента)	18	I. изолировать)	18	I.Шалит
Штамм A. niger № 2	дикий тип (изолят пациента)	18	I. Шалит
Штамм A. niger № 3	дикий тип (изолят пациента)	18	I. Shalit
Aspergillus flavus штамм № 1	дикий тип (изолят пациента)	18	I. Shalit
A. flavus 2 штамм дикого типа	18	I.Шалит
A. flavus штамм № 3	дикий тип (изолят пациента)	18	I. Шалит
A. flavus штамм № 4	дикий тип	18	I. Shalit
штамм Aspergillus terreus № 1	дикий тип (изолят пациента)	18	I. Shalit
A. terreus 2	18	I.Шалит
Fusarium solani 603251	дикий тип (изолят пациента)	19	I. .Шалит
F. solani 600679	дикий тип (изолят пациента)	19	I. Я.Шалит
F. oxysporum 600711	дикий тип (изолят пациента)	19	И. Шалит
F. oxysporum 601761	906 дикий тип 906 пациент I. Shalit
Rhizopus arrhizus 156	дикий тип (изолят пациента)		I. Shalit
C. albicans ATCC 2901	дикий тип	пациент	Э.Segal
C. albicans ATCC	дикий тип (изолят пациента)		E. Segal
C. albicans 58455	дикий тип (изолят пациента	E
C. albicans 89122	дикий тип (изолят пациента)		E. Segal
ΔAfuEcm33	AF293.1: Δecm :: pyr4; ΔpyrG	20	наша лаборатория.
ΔPmt1	CEA17 Δpmt1 :: pyrG; ΔpyrG	21	C. Jin
ΔCnaA	AF293.1: ΔcnaA :: pyrG; ΔpyrG	22, 23	W. Steinbach
ATCC 13073	TRB-чувствительный A. fumigatus штамм	24	D.S. Perlin
S678Y	FKS-S678Y	24	D.S. Perlin
ΔPkaA	pabaA A, pabaA ΔargB :: trpC ; trpC801, veA1	25	N.P. Келлер
ΔMpkA	pyrG89 ; ΔmpkA :: pyrG	26, 27	S. Osmani
ΔNikA	pabaA1 yA2 ΔnikA :: AfpyrG veA1	28 90 J.Агирре
ΔCalI11	calI11; gmtA :: NcPyr4; pyrG89; wA3; pyroA4	29	T.W. Хилл
ΔSwoA1	swoA1; pyrG89; wA3; veA1	30	М. Момани
ΔSwoM	swoM1; pyrG89; pabaA6; veA1	31	M. Momany
A. fumigatus G10 (CBS 144–89)	niiA	33	J.P. Latge
ΔchsG	chsG; Ble (фосфотрансфераза флеомицин B)	32	E. Mellado
ΔAgs1	ags1; Hph (фосфотрансфераза гигромицин B)	33	J.P. Latge
ΔGel2	gel2; Ble	34	J.P. Latge

Таблица 1

Штаммы, использованные в этом исследовании

пациент дикий тип66 (изолят пациента) (изолят пациента)66 штамм № 1 wild66 (изолят пациента) . Segal

Штаммы .	Генотип .	Арт. .	Источник .
A. nidulans штамм R153	wA2; pyroA4		FGSC
A. nidulans штамм GR-5	wA3; pyrG89 ; pyroA4		G.S. May
A. nidulans штамм alcA-PKC	wA2; pyroA4; pyrG89 :: pyr4 alcA (p) :: pkcAΔp	9	наша лаборатория.
A. fumigatus AF293 / FGSC A1100	дикий тип (изолят пациента)	17	FGSC
A. fumigatus штамм № 1	штамм		I. Шалит
A. fumigatus штамм № 2	дикий тип (изолят пациента)	18	I. изолировать)	18	I.Шалит
Штамм A. niger № 2	дикий тип (изолят пациента)	18	I. Шалит
Штамм A. niger № 3	дикий тип (изолят пациента)	18	I. Shalit
Aspergillus flavus штамм № 1	дикий тип (изолят пациента)	18	I. Shalit
A. flavus 2 штамм дикого типа	18	I.Шалит
A. flavus штамм № 3	дикий тип (изолят пациента)	18	I. Шалит
A. flavus штамм № 4	дикий тип	18	I. Shalit
штамм Aspergillus terreus № 1	дикий тип (изолят пациента)	18	I. Shalit
A. terreus 2	18	I.Шалит
Fusarium solani 603251	дикий тип (изолят пациента)	19	I. .Шалит
F. solani 600679	дикий тип (изолят пациента)	19	I. Я.Шалит
F. oxysporum 600711	дикий тип (изолят пациента)	19	И. Шалит
F. oxysporum 601761	906 дикий тип 906 пациент I. Shalit
Rhizopus arrhizus 156	дикий тип (изолят пациента)		I. Shalit
C. albicans ATCC 2901	дикий тип	пациент	Э.Segal
C. albicans ATCC	дикий тип (изолят пациента)		E. Segal
C. albicans 58455	дикий тип (изолят пациента	E
C. albicans 89122	дикий тип (изолят пациента)		E. Segal
ΔAfuEcm33	AF293.1: Δecm :: pyr4; ΔpyrG	20	наша лаборатория.
ΔPmt1	CEA17 Δpmt1 :: pyrG; ΔpyrG	21	C. Jin
ΔCnaA	AF293.1: ΔcnaA :: pyrG; ΔpyrG	22, 23	W. Steinbach
ATCC 13073	TRB-чувствительный A. fumigatus штамм	24	D.S. Perlin
S678Y	FKS-S678Y	24	D.S. Perlin
ΔPkaA	pabaA A, pabaA ΔargB :: trpC ; trpC801, veA1	25	N.P. Келлер
ΔMpkA	pyrG89 ; ΔmpkA :: pyrG	26, 27	S. Osmani
ΔNikA	pabaA1 yA2 ΔnikA :: AfpyrG veA1	28 90 J.Агирре
ΔCalI11	calI11; gmtA :: NcPyr4; pyrG89; wA3; pyroA4	29	T.W. Хилл
ΔSwoA1	swoA1; pyrG89; wA3; veA1	30	М. Момани
ΔSwoM	swoM1; pyrG89; pabaA6; veA1	31	M. Momany
A. fumigatus G10 (CBS 144–89)	niiA	33	J.P. Latge
ΔchsG	chsG; Ble (фосфотрансфераза флеомицин B)	32	E. Mellado
ΔAgs1	ags1; Hph (фосфотрансфераза гигромицин B)	33	J.P. Latge
ΔGel2	gel2; Ble	34	J.P. Latge

пациент дикий тип66 (изолят пациента) (изолят пациента)66 штамм № 1 wild66 (изолят пациента) . Segal

Штаммы .	Генотип .	Арт. .	Источник .
A. nidulans штамм R153	wA2; pyroA4		FGSC
A. nidulans штамм GR-5	wA3; pyrG89 ; pyroA4		G.S. May
A. nidulans штамм alcA-PKC	wA2; pyroA4; pyrG89 :: pyr4 alcA (p) :: pkcAΔp	9	наша лаборатория.
A. fumigatus AF293 / FGSC A1100	дикий тип (изолят пациента)	17	FGSC
A. fumigatus штамм № 1	штамм		I. Шалит
A. fumigatus штамм № 2	дикий тип (изолят пациента)	18	I. изолировать)	18	I.Шалит
Штамм A. niger № 2	дикий тип (изолят пациента)	18	I. Шалит
Штамм A. niger № 3	дикий тип (изолят пациента)	18	I. Shalit
Aspergillus flavus штамм № 1	дикий тип (изолят пациента)	18	I. Shalit
A. flavus 2 штамм дикого типа	18	I.Шалит
A. flavus штамм № 3	дикий тип (изолят пациента)	18	I. Шалит
A. flavus штамм № 4	дикий тип	18	I. Shalit
штамм Aspergillus terreus № 1	дикий тип (изолят пациента)	18	I. Shalit
A. terreus 2	18	I.Шалит
Fusarium solani 603251	дикий тип (изолят пациента)	19	I. .Шалит
F. solani 600679	дикий тип (изолят пациента)	19	I. Я.Шалит
F. oxysporum 600711	дикий тип (изолят пациента)	19	И. Шалит
F. oxysporum 601761	906 дикий тип 906 пациент I. Shalit
Rhizopus arrhizus 156	дикий тип (изолят пациента)		I. Shalit
C. albicans ATCC 2901	дикий тип	пациент	Э.Segal
C. albicans ATCC	дикий тип (изолят пациента)		E. Segal
C. albicans 58455	дикий тип (изолят пациента	E
C. albicans 89122	дикий тип (изолят пациента)		E. Segal
ΔAfuEcm33	AF293.1: Δecm :: pyr4; ΔpyrG	20	наша лаборатория.
ΔPmt1	CEA17 Δpmt1 :: pyrG; ΔpyrG	21	C. Jin
ΔCnaA	AF293.1: ΔcnaA :: pyrG; ΔpyrG	22, 23	W. Steinbach
ATCC 13073	TRB-чувствительный A. fumigatus штамм	24	D.S. Perlin
S678Y	FKS-S678Y	24	D.S. Perlin
ΔPkaA	pabaA A, pabaA ΔargB :: trpC ; trpC801, veA1	25	N.P. Келлер
ΔMpkA	pyrG89 ; ΔmpkA :: pyrG	26, 27	S. Osmani
ΔNikA	pabaA1 yA2 ΔnikA :: AfpyrG veA1	28 90 J.Агирре
ΔCalI11	calI11; gmtA :: NcPyr4; pyrG89; wA3; pyroA4	29	T.W. Хилл
ΔSwoA1	swoA1; pyrG89; wA3; veA1	30	М. Момани
ΔSwoM	swoM1; pyrG89; pabaA6; veA1	31	M. Momany
A. fumigatus G10 (CBS 144–89)	niiA	33	J.P. Latge
ΔchsG	chsG; Ble (фосфотрансфераза флеомицин B)	32	E. Mellado
ΔAgs1	ags1; Hph (фосфотрансфераза гигромицин B)	33	J.P. Latge
ΔGel2	gel2; Ble	34	J.P. Latge

Экран для противогрибковых соединений

Aspergillus nidulans контрольный штамм дикого типа R153 выращивали в 96-луночных планшетах при концентрации 10 ⁴ конидий / мл в жидкой среде MM.В каждую лунку добавляли 25 мкМ соединения из библиотеки химических соединений (Chemical Diversity Inc., Сан-Диего, Калифорния), состоящей из 5000 небольших молекул, подобных лекарству.

Соединения, которые полностью подавляли рост грибов при 25 мкМ, были выбраны для дальнейшей характеристики. Чтобы оценить, подавляют ли выбранные соединения рост грибов за счет нарушения целостности клеточной стенки, штамм A. nidulans R153 и условный мутант alcA-PKC выращивали в 96-луночных планшетах в концентрации 10 ⁴ конидий. / мл в мм или ммг.В лунки добавляли 2-кратные разведения каждого выбранного соединения. МИК (минимальная ингибирующая концентрация: самая низкая концентрация лекарственного средства для полного прекращения прорастания и роста) и МЭК (минимальная эффективная концентрация: самая низкая концентрация лекарства, вызывающая явно аберрантный рост или значительное снижение роста) оценивали через 24 ч инкубации при 37 ° C. , относительно необработанных скважин. Каспофунгин (Merck, Нью-Джерси, США) или вориконазол (Pfizer, Нью-Джерси, США) использовали в качестве контроля. Соединения, для которых мутант alcA-PKC демонстрировал ≥4-кратное снижение MIC и MEC при выращивании в репрессивных (+ глицерин) условиях, были определены как «хитовые соединения».

Пангрибковый и бактериальный скрининг

Штаммы грибов и бактерий, перечисленные в таблице 1, выращивали в 96-луночных планшетах при концентрации 10 ⁴ конидий / мл в ММ с добавлением хитовых соединений и противогрибковых средств в 96-луночных планшетах. МИК оценивали после 24 ч инкубации при 37 ° C.

Культура клеток

Hit соединений оценивали на токсичность по отношению к клеткам млекопитающих с использованием линии раковых клеток человека A549 (ATCC CLL 185), полученной из карциномы легких человека, и линии клеток фибробластов эмбриона мыши NIH-3T3 (ATCC CRL-1658).

Клеточные линии выращивали в среде Игла, модифицированной Дульбекко (DMEM) с добавлением 10% фетальной телячьей сыворотки (FCS), в 10-сантиметровых планшетах для культивирования ткани (Corning, Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA). Клетки инкубировали при 37 ° C, в 5,5% CO ₂ и в увлажненной атмосфере и регулярно пересевали путем трипсинизации каждые 3-4 дня. Для определения MIC и MEC клетки высевали в 96-луночные планшеты в концентрации 5 × 10 90 · 10 9 4 90 · 110 клеток / лунку. После 24 ч инкубации добавляли пораженные соединения и снова инкубировали при 37 ° C в 5.5% CO ₂ и во влажной атмосфере. Через еще 24 ч инкубации жизнеспособность клеток измеряли с помощью анализа XTT [2,3-бис- (2-метокси-4-нитро-5-сульфофенил) -2H-тетразолий-5-карбоксанилид, динатриевая соль] (Biological Industries, Beit Хаемек, Израиль). МИК и МЭК на основе ХТТ были определены как самые низкие концентрации лекарственного средства для полного ингибирования или значительного уменьшения образования красителя, соответственно.

Анализ чувствительности мутантных штаммов Aspergillus fumigatus и A.нидуланы к CW-11

Чтобы пролить свет на механизм действия CW-11, мы проверили мутантов A. fumigatus и A. nidulans на измененную чувствительность к этому соединению. A. fumigatus и Были выбраны штаммы A. nidulans , мутировавшие в генах, участвующих в биосинтезе клеточной стенки и основных путях передачи сигнала. MIC CW-11 для этих штаммов оценивали, как описано выше, и сравнивали с таковыми для вориконазола и каспофунгина.

Микроскопия и окрашивание

Действие поражающих соединений на ультраструктуру грибов оценивали с помощью световой и флуоресцентной микроскопии после окрашивания ядер, клеточных стенок и витальных клеток. Aspergillus fumigatus конидий в концентрации 10 ⁴ конидий / мл инкубировали в течение 24 часов при 37 ° C на стеклянных покровных стеклах в 24-луночных планшетах (Nunclon; Nalge Nunc, Роскилле, Дания), содержащих 1 мл ММ / лунку в наличие CW-11 (0,2 мкг / мл). Через 24 часа покровные стекла использовали для микроскопического анализа.Микроскопию выполняли с помощью микроскопа Olympus BX-40 (оборудованного для флуоресценции УФ-фильтром и фильтром FITC) при увеличении × 400. Изображения были записаны на камеру Olympus DP70.

Для ядерного 4 ‘, 6-диамидино-2-фенилиндола (DAPI) окрашивания покровные стекла фиксировали в 50 мМ KH ₂ PO ₄ pH 6,8, 5% (об. / Об.) Глутарового альдегида, 0,2% (мас. / Об.) v) Тритон X-100 в течение 30 минут при комнатной температуре, окрашенный 50 мкг / мл DAPI в течение 15 минут, дважды промытый PBS и проанализирован. Для окрашивания CFW проростки окрашивали в течение 45 мин при комнатной температуре и в темноте CFW (0.1 мг / мл в DDW). После окрашивания проростки дважды промывали PBS и анализировали. Для окрашивания мертвых конидий и гиф DiBAC [бис- (1,3-дибутилбарбитуровая кислота) триметиноксонол] клетки окрашивали DiBAC (2 мкг / мл в 100 мМ буфере MOPS, pH 7,0) в течение 1 ч при комнатной температуре, промывали дважды с PBS и проанализировали.

Результаты

Экран противогрибковых соединений, дестабилизирующих клеточную стенку

Чтобы идентифицировать соединения с противогрибковой активностью, мы проверили 5000 молекул, подобных лекарствам, из разнообразной библиотеки химических соединений (Chemical Diversity Inc.) (Рисунок 1A). Каждое соединение первоначально тестировали на общую противогрибковую активность против спор A. nidulans дикого типа, прорастающих в 96-луночных микротитровальных планшетах на определенной жидкой среде (MM) в течение 24 часов роста при 37 ° C. Все соединения были протестированы при единственной концентрации 25 мкМ. Лунки сканировали с помощью инвертированного микроскопа при увеличении × 40. Мы идентифицировали 47 соединений, которые значительно ингибировали прорастание и рост грибов в концентрации 25 мкМ. Из них 23 соединения частично ингибировали рост (MIC> 25 мкМ; MEC <25 мкМ), а 24 соединения полностью ингибировали рост грибов (MIC <25 мкМ).Соединения из последней группы были отобраны для дальнейшей характеристики в мутанте alcA-PKC в индуцирующих (MM + глицерин) и репрессивных (MM) условиях. Три из 24 соединений (CW-8, 11 и 17) ингибировали мутант alcA-PKC по крайней мере в 4 раза сильнее при выращивании в условиях репрессии PKC, что позволяет предположить, что они действуют, нарушая (прямо или косвенно) целостность клеточной стенки (рисунок 1B и таблица 2). Важно отметить, что штамм alcA-PKC показал чувствительность дикого типа к соединениям при выращивании в индуцирующей среде (таблица 2).Дальнейшая характеристика была проведена на CW-11, поскольку он был наиболее мощным ингибитором дикого типа A. fumigatus при определенной MM (MIC = 0,8 мг / л) и показал наибольшее изменение значений MIC и MEC в alcA. -PKC мутант при переходе от индуцирующих условий к репрессивным.

Рисунок 1

(а) Схематическое изображение шагов, используемых на экране для идентификации соединений, повреждающих клеточную стенку. (б) Химическая структура CW-8, CW-11 и CW-17.

Рисунок 1

(a) Схематическое изображение шагов, используемых на экране для идентификации соединений, повреждающих клеточную стенку. (б) Химическая структура CW-8, CW-11 и CW-17.

Таблица 2 MIC и MEC

CW-8, CW-11 и CW-17 (мг / л)

2 9080 9067 9067 9067 9067

.	CW-8 .				CW-11 .				CW-17 .
.	ММ .		ММ + глицерин .		ММ .		ММ + глицерин .		ММ .		ММ + глицерин .
Штамм .	микрофон .	MEC .	микрофон .	MEC .	микрофон .	MEC .	микрофон .	MEC .	микрофон .	MEC .	микрофон .	MEC .
Дикий тип	1,6	0,8	0,4	0,1	0,8	0,2	0,8	0,4	> 25	0,1
alcA-PKC	0,1	0,025	0,4	0,05	0,2	0,05	0,8	0,4	0,00 25167

2 9080 9067 9067 9067 9067

.	CW-8 .				CW-11 .				CW-17 .
.	ММ .		ММ + глицерин .		ММ .		ММ + глицерин .		ММ .		ММ + глицерин .
Штамм .	микрофон .	MEC .	микрофон .	MEC .	микрофон .	MEC .	микрофон .	MEC .	микрофон .	MEC .	микрофон .	MEC .
Дикий тип	1,6	0,8	0,4	0,1	0,8	0,2	0,8	0,4	> 25	0,1
alcA-PKC	0,1	0,025	0,4	0,05	0,2	0,05	0,8	0,4	0,00 25167

Таблица 2

MIC и MEC CW-8, CW-11 и CW-17 (мг / л)

906 0,05

.	CW-8 .				CW-11 .				CW-17 .
.	ММ .		ММ + глицерин .		ММ .		ММ + глицерин .		ММ .		ММ + глицерин .
Штамм .	микрофон .	MEC .	микрофон .	MEC .	микрофон .	MEC .	микрофон .	MEC .	микрофон .	MEC .	микрофон .	MEC .
Дикий тип	1,6	0,8	0,4	0,1	0.8	0,2	0,8	0,4	> 25	0,1	> 25	0,2
alcA-PKC	0,1	0,025 0,4	0,8	0,4	> 25	0,0016	> 25	12,5

6

.	CW-8 .				CW-11 .				CW-17 .
.	ММ .		ММ + глицерин .		ММ .		ММ + глицерин .		ММ .		ММ + глицерин .
Штамм .	микрофон .	MEC .	микрофон .	MEC .	микрофон .	MEC .	микрофон .	MEC .	микрофон .	MEC .	микрофон .	MEC .
Дикий тип	1,6	0,8	0.4	0,1	0,8	0,2	0,8	0,4	> 25	0,1	> 25	0,2
alcA-PKC 67
907 0,05	0,2	0,05	0,8	0,4	> 25	0,0016	> 25	12,5

CW-11 особенно активен против грибков

Специфичность CW-11 in vitro тестировали на панели грибковых, бактериальных, человеческих (A549) или мышиных (3T3) клеток в культуре (таблица 3).CW-11 был эффективен против всех важных патогенов плесени, включая виды Aspergillus и Fusarium и, в меньшей степени, Rhizopus . У этих видов CW-11 вызывал характерное набухание и лизис клеток, указывая на то, что произошло повреждение клеточной стенки (данные не показаны). Соединение частично подавляло рост патогенных дрожжей Candida albicans . Примечательным открытием является то, что CW-11 не влиял на пролиферацию бактерий и не вызывал повреждений культивируемых клеточных линий млекопитающих, как измерено подсчетом клеток (данные не показаны) и анализами пролиферации клеток на основе XTT (Таблица 3).

Таблица 3 МИК и MEC

CW-11 (мг / л)

9066 0,4 905 905 2 F. C.albicans ATCC 290166 907 907 9067 9067 9067 9067 9067 9067 9067 9067 9067 9067 9067 9067 9067 9067 Мышиные клетки ^a

.	CW-11 .
Грибок / штамм .	микрофон .	MEC .
Aspergillus spp.
A. fumigatus 293	0,4	0.2
A. fumigatus G10	1,6	0,4
A. fumigatus штамм № 1	0,4	0,2
0,2
0,1
A. niger штамм № 1	0,4	0,2
A. niger штамм № 2	0,4	0,2
	niger штамм № 3	0,8	0,2
A. flavus штамм № 1	0,8	0,4
A. flavus штамм № 2	0,8	A. flavus штамм № 3	0,8	0,4
A. flavus штамм № 4	0,8	0,4
A. terreus 9067 штамм № 1 0.4	0,1
A. terreus штамм № 2	0,4	0,1
Fusarium spp.
F. solani 251	> 25	0,4
F. solani 577	0,4	0,1
0,1
F.oxysporum 616	0,4	0,2
F. oxysporum 711	0,8	0,2
F. oxysporum 761 906 906 906	0,2
R. arrhizus 156	> 25	0,1
C. albicans
> 25	0,4
C. albicans ATCC	> 25	0.2
C. albicans 58455
C. albicans 89122	> 25	0,8
Бактерии
Escherichia coli			> 25
Bacillus cereus	> 25	> 25
Клетки человека a
3T3 9068 0	> 25	> 25

A.fumigatus штамм № 108 штамм A. № 4 F. 906 89 C. albic7 905 905 9066 cereus 906 906 906 906 906 906 906 906 907

.	CW-11 .
Грибок / штамм .	микрофон .	MEC .
Aspergillus spp.
A. fumigatus 293	0,4	0,2
A. fumigatus G10	1,6	905	0,4	0,2
A. fumigatus штамм № 2	0,4	0,1
A. niger штамм № 1	0,2	A. niger штамм № 2	0,4	0,2
A. niger штамм № 3	0,8	0,2
A. flavus штамм № 1	0,4
A. flavus штамм № 2	0,8	0,4
A. flavus штамм № 3	0,8	0,4
0,8	0,4
A. terreus штамм № 1	0,4	0,1
A. terreus штамм № 2	0,4	0.1
Fusarium spp.
F. solani 251	> 25	0,4
F. solani 577	0,4	0,1
0,1
F. oxysporum 616	0,4	0,2
F.oxysporum 711	0,8	0,2
F. oxysporum 761	0,8	0,2
Rhizopus spp.
R. arrhizus 156	> 25	0,1
C. albicans
0.4
C. albicans ATCC	> 25	0,2
C. albicans 58455	> 25	0,4
0,8
Бактерии
Escherichia coli	> 25	> 25
> 25	> 25
Клетки человека a
A549	> 25	> 25
3T3	> 25	> 25

T в состоянии 3

МИК и МЭК CW-11 (мг / л)

A.fumigatus штамм № 108 штамм A. № 4 F. 906 89 C. albic7 905 905 9066 cereus 906 906 906 906 906 906 906 906 907

.	CW-11 .
Грибок / штамм .	микрофон .	MEC .
Aspergillus spp.
A. fumigatus 293	0,4	0,2
A. fumigatus G10	1,6	905	0,4	0,2
A. fumigatus штамм № 2	0,4	0,1
A. niger штамм № 1	0,2	A. niger штамм № 2	0,4	0,2
A. niger штамм № 3	0,8	0,2
A. flavus штамм № 1	0,4
A. flavus штамм № 2	0,8	0,4
A. flavus штамм № 3	0,8	0,4
0,8	0,4
A. terreus штамм № 1	0,4	0,1
A. terreus штамм № 2	0,4	0.1
Fusarium spp.
F. solani 251	> 25	0,4
F. solani 577	0,4	0,1
0,1
F. oxysporum 616	0,4	0,2
F.oxysporum 711	0,8	0,2
F. oxysporum 761	0,8	0,2
Rhizopus spp.
R. arrhizus 156	> 25	0,1
C. albicans
0.4
C. albicans ATCC	> 25	0,2
C. albicans 58455	> 25	0,4
0,8
Бактерии
Escherichia coli	> 25	> 25
> 25	> 25
Клетки человека a
A549	> 25	> 25
3T3	> 25	> 25

A.fumigatus штамм № 108 штамм A. № 4 F. 906 89 C. albic7 905 905 9066 cereus 906 906 906 906 906 906 906 906 907

.	CW-11 .
Грибок / штамм .	микрофон .	MEC .
Aspergillus spp.
A. fumigatus 293	0,4	0,2
A. fumigatus G10	1,6	905	0,4	0,2
A. fumigatus штамм № 2	0,4	0,1
A. niger штамм № 1	0,2	A. niger штамм № 2	0,4	0,2
A. niger штамм № 3	0,8	0,2
A. flavus штамм № 1	0,4
A. flavus штамм № 2	0,8	0,4
A. flavus штамм № 3	0,8	0,4
0,8	0,4
A. terreus штамм № 1	0,4	0,1
A. terreus штамм № 2	0,4	0.1
Fusarium spp.
F. solani 251	> 25	0,4
F. solani 577	0,4	0,1
0,1
F. oxysporum 616	0,4	0,2
F.oxysporum 711	0,8	0,2
F. oxysporum 761	0,8	0,2
Rhizopus spp.
R. arrhizus 156	> 25	0,1
C. albicans
0.4
C. albicans ATCC	> 25	0,2
C. albicans 58455	> 25	0,4
0,8
Бактерии
Escherichia coli	> 25	> 25
> 25	> 25
Клетки человека a
A549	> 25	> 25
3T3	> 25	> 25

CW-11 вызывает морфологические изменения, характерные для повреждения клеточной стенки A.фумигатус

Дальнейшая характеристика эффектов CW-11 на структуру грибов была проведена на штамме A. fumigatus AF293, первоначально выделенном от пациента с инвазивным легочным аспергиллезом и впоследствии широко использованном в лабораторных исследованиях. ¹¹ Влияние CW-11 на отложение полисахаридов клеточной стенки, ядерную локализацию и жизнеспособность определяли с помощью окрашивания CFW, DAPI и DiBAC соответственно. После 24 часов роста в присутствии концентраций MEC CW-11, AF293 проявлял фенотип, характеризующийся аномальным паттерном ветвления гиф, утолщенной клеточной стенкой, содержащей повышенное содержание полисахарида и набухшими кончиками гиф (Рисунок 2A, CFW).Ядерная локализация оказалась ненормальной, с многочисленными ядрами, локализованными в набухших телах клеток и концах гиф или неравномерно распределенными вдоль гиф (рис. 2А, DAPI). Витальное окрашивание DiBAC выявило многочисленные мертвые (флуоресцирующие) сегменты гиф (рис. 2A, DiBAC).

Рисунок 2

(a) CW-11 влияет на морфологию клеток, отложение хитина, жизнеспособность клеток ядерного распределения и структуру клеточной стенки A. fumigatus AF293. Споры AF293 инкубировали при 37 ° C в течение 24 ч с и без CW-11 (0.4 мкг / мл). CW-11 вызывал изменения морфологии стенок и изменения отложения хитина, как показано окрашиванием CFW (верхняя панель). Ядра, окрашенные DAPI на второй панели, неправильно локализованы и распределены случайным образом. На третьей панели окрашивание DiBAC показывает мертвые клетки в обработанном образце, тогда как все необработанные клетки являются живыми. На нижней панели показаны морфологические изменения клеточной стенки после обработки CW-11, полученные с помощью просвечивающего электронного микроскопа (ТЕМ). (б) Дефекты ультраструктуры клеточной стенки клеток AF293, обработанных CW-11.ТЕМ необработанной клетки (вверху справа) и обработанной клетки (вверху слева). Перед фиксацией штаммы выращивали в течение 16 ч при 37 ° C на жидкой среде MM с CW-11 (0,4 мкг / мл) или без него. Обратите внимание на утолщение клеточной стенки обработанных клеток. Многочисленные клетки лизировались с образованием пустых «призрачных» клеток (нижняя панель).

Рисунок 2

(a) CW-11 влияет на морфологию клеток, отложение хитина, жизнеспособность клеток ядерного распределения и структуру клеточной стенки A. fumigatus AF293. Споры AF293 инкубировали при 37 ° C в течение 24 ч с и без CW-11 (0.4 мкг / мл). CW-11 вызывал изменения морфологии стенок и изменения отложения хитина, как показано окрашиванием CFW (верхняя панель). Ядра, окрашенные DAPI на второй панели, неправильно локализованы и распределены случайным образом. На третьей панели окрашивание DiBAC показывает мертвые клетки в обработанном образце, тогда как все необработанные клетки являются живыми. На нижней панели показаны морфологические изменения клеточной стенки после обработки CW-11, полученные с помощью просвечивающего электронного микроскопа (ТЕМ). (б) Дефекты ультраструктуры клеточной стенки клеток AF293, обработанных CW-11.ТЕМ необработанной клетки (вверху справа) и обработанной клетки (вверху слева). Перед фиксацией штаммы выращивали в течение 16 ч при 37 ° C на жидкой среде MM с CW-11 (0,4 мкг / мл) или без него. Обратите внимание на утолщение клеточной стенки обработанных клеток. Многочисленные клетки лизировались с образованием пустых «призрачных» клеток (нижняя панель).

Для дальнейшего определения влияния CW-11 на ультраструктуру клеточной стенки мы проанализировали клеточную стенку обработанных клеток AF293 с помощью просвечивающей электронной микроскопии (ТЕМ). Свежесобранные конидии из штамма AF293 выращивали в течение 24 ч при 37 ° C в присутствии CW-11 при концентрации MEC.Результаты показывают, что в присутствии CW-11 штамм AF293 проявляет дефекты в ультраструктуре клеточной стенки, характеризующиеся аномальным утолщением и фрагментацией внешней клеточной стенки (рис. 2А, нижняя панель). Многочисленные клетки показали частичную или полную потерю цитозоля (рис. 2В), что свидетельствует о том, что они подверглись процессу коллапса и распада. Этот литический процесс, вероятно, был результатом ослабления клеточной стенки из-за активности CW-11.

Измененная чувствительность мутантных штаммов Aspergillus к CW-11

Чтобы расширить наше понимание механизма действия CW-11, мы провели поиск генов, делеция которых привела к изменению восприимчивости к этому соединению.Мы выбрали A. fumigatus и A. nidulans мутантных штаммов, удаленных по генам, участвующим в основных путях биосинтеза грибковой стенки и сигнальной трансдукции. Штаммы тестировали на чувствительность к CW-11 в сравнении с противогрибковыми препаратами вориконазол (ингибитор биосинтеза мембранного эргостерола) и каспофунгин (ингибитор глюкансинтазы и биосинтеза клеточной стенки). Интересно, что повышенная устойчивость к CW-11 была обнаружена у штаммов A. fumigatus , удаленных в ChsG (синтез хитина), Ags1 (синтез α-глюкана), Gel2 (активность 1,3-β-глюканозилтрансферазы). , Ecm33 (участвует в организации клеточной стенки) или Pmt1 (маннозилирование белков клеточной стенки) и в A.nidulans , удаленные в PkaA (передача сигналов цАМФ) или NikA (передача сигналов гистидинкиназы) (Таблица 4). Повышенная чувствительность к CW-11 была обнаружена у штаммов A. nidulans , удаленных по генам MpkA, (передача сигналов MAP-киназы) или CalI (транспорт GDP-маннозы). В целом профили чувствительности мутантов к CW-11, вориконазолу и каспофунгину заметно различаются, что позволяет предположить, что CW-11 подавляет рост грибов через другую клеточную мишень.

Таблица 4 Чувствительность мутантов к CW-11 по сравнению с каспофунгином или вориконазолом (мг / л)

12676 907 0,807 0,807 0,807 0,4 906 ΔPmt1 12,5 ²⁵ 0,2 ΔCalI11 0,4 SwoM ³¹ 0,4 0,05

.	.	Каспофунгин .		Вориконазол .		CW-11 .
Виды / штамм .	Ген удален / аннотация .	микрофон .	MEC .	микрофон .	MEC .	микрофон .	MEC .
A. fumigatus
AF293		908 .8	0,2
ΔEcm33	Организационный белок заякоренной клеточной стенки GPI AfuEcm33 20	> 12,5	0,2	1,6
протеинманнозилтрансфераза 21	> 12,5	0,2	0,4	0,2	> 12,5	0.2
ΔCnaA	каталитическая субъединица кальциневрина CnaA 22,23	> 12,5	0,1	0,8	0,2	0,4 906 906 906 9067 9067 906 906 9067 штамм	> 12,5	0,025	3,125	0,8	1,6	0,4
ΔChsG	хитинсинтаза G субъединица 32	10 9065	0,003	0,4	0,2	> 12,5	0,8
ΔAgs1	α-глюкан-синтаза 1 33	> 12,5	> 12,5	> 12,5
ΔGel2	β (1,3) -глюканозилтрансфераза 34	> 12,5	0,05	0,4	0.05	> 12,5	> 12,5
ATCC 13073	родительский штамм	> 12,5	0,1	0,4	0,2	> 25	3,1	906	3,1	1,5	0,2	0,1	> 25	3,1
A. нидуланс			9067	9067 906 родительский штамм	> 12.5	0,05	0,1	0,02	0,1	0,02
ΔPkaA	протеинкиназа A каталитическая субъединица 25	0,4	0,8
ΔMpkA	митоген-активированная протеинкиназа MpkA 26,27	0,01	0,006	0.05	0,02	0,006	ND
ΔNikA	гистидиновая протеинкиназа 28,35	0,8	0,2	0,2
GDP-переносчик маннозы (GMT) 29	6,2	0,1	0,2	0,05	0,05	0,006
os протеин Atras Otras 30	6.2	0,05	0,2	0,006	0,2	0,01
ΔSwoM	фосфоглюкозоизомераза SwoM 31

907,5 0,46 ^22,23 6 908glugs 1 ³³ 6 0,1 906 6 9067 N067 6.2

.	.	Каспофунгин .		Вориконазол .		CW-11 .
Виды / штамм .	Ген удален / аннотация .	микрофон .	MEC .	микрофон .	MEC .	микрофон .	MEC .
A. fumigatus
AF293		родительский штамм.5	0,1	0,8	0,4	0,8	0,2
ΔEcm33	GPI-закрепленный белок для организации клеточной стенки AfuEcm33 1,6780	> 12,5	0,2
ΔPmt1	протеинманнозилтрансфераза 21	> 12,5	0.2	0,4	0,2	> 12,5	0,2
ΔCnaA	каталитическая субъединица кальциневрина CnaA 22,23	0,4
G10	родительский штамм	> 12,5	0,025	3,125	0,8	1,6	0.4
ΔChsG	Субъединица G хитинсинтазы 32	> 12,5	0,003	0,4	0,2	> 12,5
> 12,5	0,0125	0,4	0,2	> 12,5	> 12,5
ΔGel2	β (1,3) -трансфеканос15	0,05	0,4	0,05	> 12,5	> 12,5
ATCC 13073	родительский штамм	> 12,5	0,1	0,4 2567 3,1
0,1	0,4
S678Y	устойчивость к каспофунгину 24	3,1	1,5	0,2	0,1	> 25	3,1
A.нидуланс
R153	родительский штамм	> 12,5	0,05
каталитическая субъединица протеинкиназы А 25	0,8	0,4	0,1	0,02	0.8	0,2
ΔMpkA	митоген-активируемая протеинкиназа MpkA 26,27	0,01	0,006	0,05
гистидиновая протеинкиназа 28,35	0,8	0,2	0,2	0,05	1,6	0,4
ΔCalI11	0,1	0,2	0,05	0,05	0,006
ΔSwoA1	протеин O -маннозилтрансфераза PmtA6 906 907 907 907 907 907 907 907	0,2	0,01
ΔSwoM	фосфоглюкозоизомераза SwoM 31	0,4	0.1	0,2	0,02	0,2	0,05

Таблица 4

Мутантная чувствительность к CW-11 по сравнению с каспофунгином или вориконазолом (мг / л)

907,5 0,46 ^22,23 6 908glugs 1 ³³ 6 0,1 906 6 9067 N067 6.2

.	.	Каспофунгин .		Вориконазол .		CW-11 .
Виды / штамм .	Ген удален / аннотация .	микрофон .	MEC .	микрофон .	MEC .	микрофон .	MEC .
A. fumigatus
AF293		родительский штамм.5	0,1	0,8	0,4	0,8	0,2
ΔEcm33	GPI-закрепленный белок для организации клеточной стенки AfuEcm33 1,6780	> 12,5	0,2
ΔPmt1	протеинманнозилтрансфераза 21	> 12,5	0.2	0,4	0,2	> 12,5	0,2
ΔCnaA	каталитическая субъединица кальциневрина CnaA 22,23	0,4
G10	родительский штамм	> 12,5	0,025	3,125	0,8	1,6	0.4
ΔChsG	Субъединица G хитинсинтазы 32	> 12,5	0,003	0,4	0,2	> 12,5
> 12,5	0,0125	0,4	0,2	> 12,5	> 12,5
ΔGel2	β (1,3) -трансфеканос15	0,05	0,4	0,05	> 12,5	> 12,5
ATCC 13073	родительский штамм	> 12,5	0,1	0,4 2567 3,1
0,1	0,4
S678Y	устойчивость к каспофунгину 24	3,1	1,5	0,2	0,1	> 25	3,1
A.нидуланс
R153	родительский штамм	> 12,5	0,05
каталитическая субъединица протеинкиназы А 25	0,8	0,4	0,1	0,02	0.8	0,2
ΔMpkA	митоген-активируемая протеинкиназа MpkA 26,27	0,01	0,006	0,05
гистидиновая протеинкиназа 28,35	0,8	0,2	0,2	0,05	1,6	0,4
ΔCalI11	0,1	0,2	0,05	0,05	0,006
ΔSwoA1	протеин O -маннозилтрансфераза PmtA6 906 907 907 907 907 907 907 907	0,2	0,01
ΔSwoM	фосфоглюкозоизомераза SwoM 31	0,4	0.1	0,2	0,02	0,2	0,05

12676 907 0,8 907 0,8 906 9067C 0,05 9067 9067 9067 9067 активированная протеинкиназа MpkA ^26,27 9067 9 Обсуждение

Современные терапевтические методы лечения инвазивного аспергиллеза, включая введение новых агентов, таких как каспофунгин и вориконазол, по-прежнему связаны со значительной смертностью. ¹² Таким образом, срочно необходимы новые противогрибковые препараты, разработанные на основе информации, быстро накапливаемой в результате молекулярных исследований. В нескольких предыдущих исследованиях описано использование мутантных штаммов Saccharomyces cerevisiae , ^13,14 Candida albicans ^12,15 и Neurospora crassa ¹⁶ для идентификации новых соединений с противогрибковой активностью. Hu et al. ¹⁷ недавно создали мутанты с условной заменой промотора для 35 основных генов в A.fumigatus . Один из них, в котором условно экспрессируется ERG11A (кодирующий 14α-деметилазу, известную мишень противогрибковых препаратов на основе азолов), показал повышенную чувствительность к флуконазолу, но не к неродственному соединению туникамицину в репрессивных условиях. Однако использование этих условных мутантов A. fumigatus для идентификации новых противогрибковых соединений до сих пор не описано.

В этом исследовании мы использовали условный мутант alcA-PKC , созданный нами в A.nidulans ⁹ для идентификации небольших молекул, подобных лекарству, которые нарушают клеточную стенку. Этот мутант является сверхчувствительным к повреждению клеточной стенки только при выращивании в репрессивной среде, содержащей глюкозу, потому что в этих условиях транскрипция PKC подавляется, а ответ целостности клеточной стенки, зависимый от PKC , блокируется. Напротив, на среде, индуцирующей alcA-PKC (содержащей глицерин), штамм показывает нормальную восприимчивость к повреждению клеточной стенки. ⁹ Новизна в этом подходе состоит в том, что мутант alcA-PKC позволяет нам различать соединения, которые ингибируют общий рост грибов, и соединения, которые ингибируют целостность и функцию клеточной стенки.Дополнительным преимуществом этого подхода является то, что скрининг проводится в интактных грибковых клетках, а не в очищенных белках-мишенях. Это исключает выделение соединений, которые не могут проникать через биологические мембраны или являются цитотоксичными.

Мы проверили библиотеку из 5000 случайно выбранных малых молекул на предмет соединений, проявляющих повышенную противогрибковую активность против штамма alcA-PKC в репрессивных условиях. Мы идентифицировали три соединения (CW-8, 11 и 17). Интересно, что они химически связаны; все они представляют собой производные ароматического замещенного гидразина (N – N), содержащие орто-замещенные фенольные и галогенированные бензильные кольца.Ни один из них не был ранее описан в научной литературе как обладающий противогрибковой активностью, что позволяет предположить, что они являются новыми противогрибковыми соединениями.

Наиболее эффективное из трех соединений, CW-11, было дополнительно охарактеризовано и показано, что оно обладает несколькими свойствами ведущего противогрибкового соединения: (i) он специфически подавляет рост грибов, а не пролиферацию клеток бактерий или млекопитающих в культуре; и (ii) микроскопический анализ показал, что он вызывает обширное повреждение клеточной стенки, характеризующееся набуханием, утолщением и лизисом.

Чтобы первоначально охарактеризовать механизм действия CW-11, мы проверили его способность ингибировать мутантных штаммов A. fumigatus и A. nidulans , удаленных для генов, участвующих в биосинтезе стенок грибов и передаче сигналов. Такое «химическое геномное профилирование» широко используется в дрожжах и основано на предпосылке, что гены, делеция которых влияет на восприимчивость к лекарствам, прямо или косвенно участвуют в способе действия лекарства. ¹² Наши результаты, основанные на различных профилях чувствительности мутантных штаммов к каспофунгину, вориконазолу и CW-11, предполагают, что CW-11 действует через другой клеточный механизм.Неожиданно мы обнаружили, что несколько мутантов, лишенных генов, участвующих в биогенезе клеточной стенки ( ChsG , Ags1 , Gel2 , Ecm33) показали повышенную устойчивость к CW-11. В дрожжах S. cerevisiae дефекты биогенеза клеточной стенки активируют каскад киназ, активируемых PKC / митогеном, что приводит к активации пути целостности клеточной стенки и последующему восстановлению клеточной стенки. ⁸ Мы предполагаем, что целостность клеточной стенки (CWI) / PKC-зависимый путь у этих мутантов активируется из-за их дефектной клеточной стенки и что один из компонентов этого пути является мишенью для CW-11.Это согласуется с нашим открытием, что делеция митоген-активированной киназы MpkA , компонента CWI / PKC-зависимого пути, приводит к повышенной чувствительности к CW-11. Хотя точный механизм действия CW-11 требует дальнейшего изучения, мы обнаружили, что интригующе, что его противогрибковая активность отменяется в богатой среде, содержащей высокие (мМ) уровни аминокислоты цистеина (Г. Миркус и Н. Ошеров, неопубликованные результаты ).

Таким образом, мы представляем доказательство концепции давней идеи использования индуцибельных мутантных штаммов для выделения противогрибковых соединений.Мы предполагаем, что скрининг противогрибковых соединений, повреждающих клеточную стенку, еще далеко не исчерпан и должен быть продолжен с библиотеками, состоящими из сотен тысяч соединений. Кроме того, скрининг может быть улучшен и уточнен путем создания и скрининга дополнительных условных мутантов в основных генах биосинтеза клеточной стенки.

Финансирование

Это исследование было поддержано Израильской онкологической ассоциацией (200) и грантом Медицинской школы Саклера Н.O.

Заявления о прозрачности

Отсутствуют для объявления.

Список литературы

1« и др.

Тенденции смертности от инвазивных грибковых заболеваний в США, 1980–1997 гг.

,

Clin Infect Dis

,

2001

, vol.

33

(стр.

641

—

7

) 2« и др.

Тенденции патологоанатомической эпидемиологии инвазивных грибковых инфекций в университетской больнице

,

J Infect

,

1996

, vol.

33

(стр.

23

—

32

) 3. ,

Грибковая инфекция, диагностика и лечение

,

2003

Oxford

Blackwell Publishing Ltd

4.

Ранняя диагностика инвазивного аспергиллеза

,

Lancet

,

2000

, vol.

355

(стр.

423

—

4

) 5. ,

Мировой рынок противоинфекционных препаратов Том I: Противогрибковые препараты

,

2007

2-е изд.

Роквилл, Мэриленд, США

Kalorama Ltd

6.,

Противогрибковые препараты: достижения и проблемы

,

2004

Швейцария

Birkhauser Verlag

7,.

Эхинокандины

,

Фармакотерапия

,

2007

, т.

27

(стр.

369

—

88

) 8,.

Эволюция, биохимия и генетика протеинкиназы С у грибов

,

Curr Genet

,

2003

, vol.

43

(стр.

245

—

54

) 9« и др.

Ген Aspergillus nidulans pkcA участвует в поляризованном росте, морфогенезе и поддержании целостности клеточной стенки

,

Curr Genet

,

2007

, vol.

51

(стр.

321

—

9

) 10,,, et al.

JX401, ингибитор p38α, содержащий мотив 4-бензилпиперидина, идентифицированный с помощью новой системы скрининга в дрожжах

,

Mol Pharmacol

,

2006

, vol.

70

(стр.

1395

—

405

) 11« и др.

Изучение генома Aspergillus fumigatus : анализ области 922 т.п.н., охватывающей кластер генов ассимиляции нитратов

,

Fungal Genet Biol

,

2004

, vol.

41

(стр.

443

—

53

) 12,,, et al.

Крупномасштабная идентификация основных генов у Candida albicans и приложения к открытию противогрибковых препаратов

,

Mol Microbiol

,

2003

, vol.

50

(стр.

167

—

81

) 13.

Пекарские дрожжи как инструмент для разработки противогрибковых препаратов, воздействующих на целостность клеток — обновление

,

Exp Op Drug Disc

,

2008

, vol.

3

(стр.

931

—

43

) 14« и др.

Химико-генетические подходы к изучению механизма действия натуральных продуктов

,

Prog Drug Res

,

2008

, vol.

66

(стр.

237, 239

—

71

) 15« и др.

Основанный на антисмысле функциональный подход к геномике для идентификации генов, критических для роста Candida albicans

,

Nat Biotechnol

,

2001

, vol.

19

(стр.

235

—

41

) 16,.

Идентификация новых противогрибковых соединений, действующих на клеточную стенку

,

Int J Antimicrob Agents

,

2006

, vol.

28

(стр.

361

—

5

) 17« и др.

Идентификация основных генов и приоритезация мишеней для лекарств в Aspergillus fumigatus

,

PLoS Pathog

,

2007

, vol.

3

стр.

e24

18« и др.

Синергия каспофунгина и итраконазола in vitro против Aspergillus spp.: МИК в сравнении с конечными точками минимальной эффективной концентрации

,

Противомикробные агенты Chemother

,

2003

, vol.

47

(стр.

1416

—

8

) 19« и др.

Синергия каспофунгина in vitro с лицензированными и новыми противогрибковыми препаратами против клинических изолятов Fusarium spp

,

Med Mycol

,

2008

, vol.

13

(стр.

1

—

6

) 20,,, et al.

Нарушение гомолога Aspergillus fumigatus ECM33 приводит к быстрому прорастанию конидий, противогрибковой устойчивости и гипервирулентности

,

Microbiology

,

2006

, vol.

152

(стр.

1919

—

28

) 21« и др.

О-маннозилтрансфераза 1 в Aspergillus fumigatus (AfPmt1p) имеет решающее значение для целостности клеточной стенки и морфологии конидий, особенно при повышенной температуре

,

Eukaryot Cell

,

2007

, vol.

6

(стр.

2260

—

8

) 22,,, et al.

Кальциневрин контролирует рост, морфологию и патогенность у Aspergillus fumigatus

,

Eukaryot Cell

,

2006

, vol.

5

(стр.

1091

—

103

) 23« и др.

Ингибирование или мутация кальциневрина усиливает действие ингибиторов клеточной стенки против Aspergillus fumigatus

,

Противомикробные агенты Chemother

,

2007

, vol.

51

(стр.

2979

—

81

) 24« и др.

Характеристика мутантов Aspergillus fumigatus с пониженной чувствительностью к каспофунгину

,

Med Mycol

,

2005

, vol.

43

Дополнение 1

(стр.

S299

—

305

) 25,.

Генетическое участие цАМФ-зависимой протеинкиназы в сигнальном пути G-белка, регулирующем морфологические и химические переходы у Aspergillus nidulans

,

Genetics

,

2001

, vol.

157

(стр.

591

—

600

) 26,.

Активированная митогеном протеинкиназа (MPKA) участвует в поляризованном росте мицелиальных грибов, Aspergillus nidulans

,

FEMS Microbiol Lett

,

1999

, vol.

173

(стр.

117

—

25

) 27« и др.

MpkA-зависимая и -независимая передача сигналов целостности клеточной стенки у Aspergillus nidulans

,

Eukaryot Cell

,

2007

, vol.

6

(стр.

1497

—

510

) 28« и др.

Регуляторы ответа SrrA и SskA являются центральными компонентами фосфорелейной системы, участвующей в передаче стрессового сигнала и бесполой споруляции у Aspergillus nidulans

,

Eukaryot Cell

,

2007

, vol.

6

(стр.

1570

—

83

) 29,,, et al.

Два переносчика GDP-маннозы способствуют формированию гиф и целостности клеточной стенки у Aspergillus nidulans

,

Microbiology

,

2008

, vol.

154

(стр.

2037

—

47

) 30,,.

Мутанты Aspergillus nidulans swo обнаруживают дефекты в установлении полярности, поддержании полярности и морфогенезе гиф

,

Genetics

,

1999

, vol.

151

(стр.

557

—

67

) 31,.

Мутант фосфоглюкозоизомеразы в Aspergillus nidulans имеет дефект по полярности гиф и конидиации

,

Fungal Genet Biol

,

2006

, vol.

43

(стр.

739

—

51

) 32« и др.

Гены Aspergillus fumigatus chsC и chsG кодируют хитинсинтазы класса III с различными функциями

,

Mol Microbiol

,

1996

, vol.

20

(стр.

667

—

79

) 33« и др.

Две α (1-3) глюкансинтазы с разными функциями у Aspergillus fumigatus

,

Appl Environ Microbiol

,

2005

, vol.

71

(стр.

1531

—

8

) 34« и др.

Удаление GEL2 , кодирующего β (1-3) глюканозилтрансферазу, влияет на морфогенез и вирулентность у Aspergillus fumigatus

,

Mol Microbiol

,

2005

, vol.

56

(стр.

1675

—

88

) 35« и др.

Характеристика гистидинкиназы NikA, участвующей в передаче сигнала фосфора у Aspergillus nidulans , с особым упором на фунгицидные реакции

,

Biosci Biotechnol Biochem

,

2007

, vol.

71

(стр.

844

—

7

)

© Автор 2009. Опубликовано Oxford University Press от имени Британского общества антимикробной химиотерапии.Все права защищены. Для получения разрешений обращайтесь по электронной почте: [email protected]

.

Произошла ошибка при настройке пользовательского файла cookie

Этот сайт использует файлы cookie для повышения производительности. Если ваш браузер не принимает файлы cookie, вы не можете просматривать этот сайт.

---

Настройка вашего браузера для приема файлов cookie

Существует множество причин, по которым cookie не может быть установлен правильно. Ниже приведены наиболее частые причины:

• В вашем браузере отключены файлы cookie.Вам необходимо сбросить настройки вашего браузера, чтобы он принимал файлы cookie, или чтобы спросить вас, хотите ли вы принимать файлы cookie.
• Ваш браузер спрашивает вас, хотите ли вы принимать файлы cookie, и вы отказались. Чтобы принять файлы cookie с этого сайта, нажмите кнопку «Назад» и примите файлы cookie.
• Ваш браузер не поддерживает файлы cookie. Если вы подозреваете это, попробуйте другой браузер.
• Дата на вашем компьютере в прошлом. Если часы вашего компьютера показывают дату до 1 января 1970 г., браузер автоматически забудет файл cookie.Чтобы исправить это, установите правильное время и дату на своем компьютере.
• Вы установили приложение, которое отслеживает или блокирует установку файлов cookie. Вы должны отключить приложение при входе в систему или проконсультироваться с системным администратором.

---

Почему этому сайту требуются файлы cookie?

Этот сайт использует файлы cookie для повышения производительности, запоминая, что вы вошли в систему, когда переходите со страницы на страницу. Чтобы предоставить доступ без файлов cookie потребует, чтобы сайт создавал новый сеанс для каждой посещаемой страницы, что замедляет работу системы до неприемлемого уровня.

---

Что сохраняется в файле cookie?

Этот сайт не хранит ничего, кроме автоматически сгенерированного идентификатора сеанса в cookie; никакая другая информация не фиксируется.

Как правило, в файлах cookie может храниться только информация, которую вы предоставляете, или выбор, который вы делаете при посещении веб-сайта. Например, сайт не может определить ваше имя электронной почты, пока вы не введете его. Разрешение веб-сайту создавать файлы cookie не дает этому или любому другому сайту доступа к остальной части вашего компьютера, и только сайт, который создал файл cookie, может его прочитать.

библиотек противогрибковых соединений — Creative Biolabs

Creative Biolabs предлагает специализированные / разнообразные библиотеки противогрибковых соединений. Используя широкие технологии органического и параллельного синтеза (например, высокую производительность, параллельный синтез в малых объемах и синтез в средних и больших объемах), Creative Biolabs имеет возможность разрабатывать и синтезировать высококачественные биологически активные соединения, необходимые для различных целей. Мы предлагаем нашим клиентам наиболее подходящий метод синтеза с точки зрения стоимости, времени и масштабируемости.

Библиотека соединений — это коллекция соединений, используемых при высокопроизводительном скрининге или промышленном производстве. Каждое соединение имеет связанную с ним информацию, такую ​​как химическая структура, чистота, количество и физико-химические характеристики. Хранимые библиотеки соединений должны иметь полностью представленное или отобранное химическое пространство для предотвращения молекулярных взаимодействий.

Библиотеки соединений — полезные инструменты для открытия лекарств. Мы предоставляем несколько типов библиотек противогрибковых соединений, включая библиотеку натуральных продуктов, библиотеки, специфичные для мишеней (такие как полиены, азолы и эхинокандины), и одобренную FDA библиотеку противогрибковых препаратов.Наши готовые к использованию библиотеки соединений состоят из более чем 3000 молекул, их биологическая и фармакологическая активность полностью подтверждена. Эти библиотеки доступны для высокопроизводительного скрининга (HTS), скрининга на основе фрагментов и скрининга с высоким содержанием (HCS).

Библиотека натуральных продуктов

Недавние исследования показали, что два из трех основных классов используемых в настоящее время противогрибковых средств, таких как полиен и эхинокандины, получены из натуральных продуктов.При выборе противогрибковых препаратов по-прежнему уделяется внимание натуральным продуктам, которые представляют собой самые изысканные примеры лечения — отбор по их активности путем эволюции. В Creative Biolabs мы продолжаем усилия по библиотеке натуральных продуктов. Наша библиотека состоит из 800 чистых природных соединений в качестве материалов для идентификации потенциальных клиентов. Доступны источники и справочная информация (например, химическая структура, чистота, количество и физико-химические характеристики) наших природных образцов. Эта обширная библиотека разнообразия по-прежнему имеет большое значение для выбора противогрибковых препаратов, применимых к различным мишеням.

Целевые библиотеки

До сих пор терапевтические возможности инвазивных грибковых инфекций весьма ограничены и включают только три основных класса лекарств: полиены, азолы и эхинокандины. Полиены — старейший класс противогрибковых препаратов. Этот класс противогрибковых препаратов, таких как амфотерицин B, связывается с эргостеролом, мембранным стерином, который является уникальным для грибов, для лечения системных инфекций. Самый распространенный класс противогрибковых средств, идентифицированный в библиотеке натуральных продуктов, — это эхинокандины, которые подавляют синтез 1,3-β-глюкана, ключевого компонента клеточной стенки грибов.Азолы представляют собой самый распространенный класс при скрининге синтетических химических библиотек, которые ингибируют биосинтез эргостерина. Также включены другие противогрибковые библиотеки, например аллиламины и морфолины, которые ингибируют биосинтез эргостерола; флуцитозин и гризеофульвин, которые подавляют биосинтез нуклеиновых кислот и митоз.

Библиотека противогрибковых препаратов, одобренная FDA

Продукты, одобренные FDA, более безопасны и эффективны. Эти продукты уже подтверждены литературой, патентными отчетами и клиническими исследованиями.Мы предлагаем новейшие медицинские молекулы и доступ к нашим библиотекам противогрибковых препаратов.

Creative Biolabs посвящена открытию инновационных противогрибковых препаратов, которые используют передовые методологии и технологии для обращения к химическим библиотекам, мишеням и путям. Для получения более подробной информации, пожалуйста, свяжитесь с нами или отправьте нам запрос напрямую.

Номер ссылки

1. Ремер Т. и Крысан Диджей (2014).Разработка противогрибковых препаратов: проблемы, неудовлетворенные клинические потребности и новые подходы. Cold Spring Harb Perspect Med 4: a019703.

Только для исследовательских целей.

Джавсамицин проявляет противогрибковые свойства in vivo за счет ингибирования Spt14 / Gpi3-опосредованного биосинтеза гликозилфосфатидилинозитола

Конструкция репортерного штамма GPI

Последовательность ДНК, кодирующая Gaussia princeps , ДНК-последовательность, кодирующая Gaussia princeps. ¹⁸ был синтезирован (Genewiz) и клонирован в сайты EcoRI / BglII плазмиды pESC-URA. pGluc59, полученную плазмиду трансформировали в YPh599 или NF7061 для характеристики экспрессии люциферазы и разработки анализа GPI-репортера.

Разработка анализа репортера GPI

Для разработки анализа дрожжевые клетки (NF7061, трансформированные pGluc59) ночной культуры, выращенные в 20 мл селекционной среды глюкозы при 30 ° C и встряхивании при 215 об / мин, осаждали и ресуспендировали до 2 × 10 ⁷ клеток / мл в 50 мл селективной среды для глюкозы.После дополнительной инкубации в течение 8 ч клетки ресуспендировали в 150 мл среды для отбора рафинозы при концентрации 1 × 10 ⁷ клеток / мл и инкубировали в течение дополнительной инкубации в течение ночи при 30 ° C при встряхивании при 215 об / мин. После этого клетки осаждали и ресуспендировали в среде, богатой рафинозой, до конечной концентрации 12 × 10 90 · 10 9 7 90 · 110 клеток / мл.

10 нл / лунку 10 мМ исходного раствора соединения наносили в аналитические планшеты (1536-луночные, черные, микропроцессорные с крышкой 190 мкм, Greiner # 7-191) с использованием акустического дозирования (Echo 550, Labcyte), получая конечную концентрацию соединения 17 мкМ.Затем 3 мкл среды для индукции галактозы, а затем 3 мкл дрожжевой суспензии 12 × 10 ⁷ клеток / мл добавляют в лунки для образцов с использованием устройства Multidrop Combi (Thermo Fisher). После инкубации в течение 16 часов 4 мкл супернатанта из первичного аналитического планшета переносили во вторичный аналитический планшет с использованием 1536-луночной пипеточной головки FDSS 7000 (Hamamatsu Inc.). Следующие 2 мкл реакционной смеси люциферазы (30 мкМ целентеразина, растворенного в буфере для люциферазной реакции (150 мМ KH ₂ PO ₄ , 750 мМ NaCl, 1.Добавляли 5 мМ EDTA в сверхчистой H _{2 (} O, pH 6,7, стерилизовано фильтрацией) и отображали с помощью считывающего устройства FDSS 7000 в режиме люминесценции и времени считывания 30 с.

Скрининг гена репортера GPI

Для скрининга ингибиторов пути GPI, 20 мл среды для селекции глюкозы (дрожжевое азотное основание без АК 6,7 г / л; d-глюкоза 20 г / л; CSM-URA 0,8 г / л ) был инокулирован штаммом дрожжей NF7061 (BY4741 MATa с snq2 :: KanMX; pdr5 :: KanMX; pdr1 :: NAT1; pdr3 :: KanMX; yap1 :: NAT1; pdr2 :: LEU2; yrm1 :: MET; и yor1: : LYS2) трансформировали pGluc59 и инкубировали при 30 ° C при встряхивании в течение 24 часов.Клетки собирали и ресуспендировали до 2 × 10 ⁷ с 50 мл селекционной среды с глюкозой и выращивали в течение дополнительных 8 часов. Клетки подсчитывали, и среду для селекции рафинозы (азотное основание дрожжей без аминокислот 6,7 г / л; d-рафиноза 20 г / л; и CSM-URA 0,8 г / л) инокулировали при концентрации клеток 1 × 10 ⁷ клеток. / мл. После 16 ч инкубации при встряхивании и 30 ° C клетки ресуспендировали до концентрации 1 × 10 ⁷ клеток / мл в среде, богатой рафинозой (d-рафиноза 20 г / л; пептон 20 г / л; дрожжевой экстракт 10 г / л и CSM-URA 0.8 г / л) и дополнительно инкубировали 60 мин при 30 ° C при встряхивании. В целом, 1536-луночные аналитические планшеты (белые, со сплошным дном, Greiner # 7-191) были приготовлены путем добавления 30 нл 2-мМ раствора соединений (с конечной концентрацией 10 мкМ) на дорожки 1–44. с использованием акустического дозирования (Echo 555, Labcyte Inc.). Нейтральный контроль (ДМСО) помещали в дорожки 45 и 46. Затем 3 мкл среды для индукции галактозы (d-галактоза 40 г / л; пептон 20 г / л; дрожжевой экстракт 10 г / л; CSM-URA 0,8 г / л. l) добавляли к дорожкам 1–46 с использованием комбинированного дозатора Multidrop (Thermo Inc.). Всего 3 мкл среды для индукции галактозы, дополненной соединениями положительного контроля, добавляют на дорожки 47–48 с помощью дозатора Preddator (Redd and Whyte Inc.). Всего 3 мкл дрожжевой суспензии (1 × 10 ⁷ клеток / мл) добавляют в каждую лунку 1536-луночного планшета с использованием Multidrop combi (Thermo). После инкубации при 30 ° C в течение 8 часов 4 мкл супернатанта каждой лунки переносили в дополнительный аналитический планшет, смешивали с 2 мкл реакционной смеси люциферазы и инкубировали в течение 20 минут при комнатной температуре.Для считывания люциферазы использовали ридер Pherastar FS (BMG Labtech, время считывания 0,1 с; высота фокуса 0,8 мм; усиление 4000).

Данные были проанализированы с помощью программного обеспечения Helios ⁴⁰ собственной разработки и нормализованы к контролю (отрицательный контроль ДМСО, ингибитор Gwt1 в конечной концентрации 10 мкМ, соответствующей его значению IC ₅₀ , использовали в качестве активного контроля, используя следующий расчет:

$$ \ begin {array} {* {20} {l}} {{\ mathrm {NC}} 1 \! \ !:} \ hfill & {{\ mathrm {xn}} = + \! / \! — 100 {\ kern 1pt} ({\ mathrm {x}} — {\ mathrm {NC}}) / ({\ mathrm {AC}} — {\ mathrm {NC}})} \ hfill \ end {array} $$

± параметр типа эффекта; NC и AC — средние значения (медиана) по соответствующим значениям нейтрального контроля (NC) и активного контроля (AC).

Тестирование ингибирования роста

Вещества были сначала проанализированы на их активность с использованием дикого типа S. cerevisiae BY4743 путем записи кривых доза-ответ ингибирования роста. OD _{600 нм} значений экспоненциально растущих культур S. cerevisiae в богатой среде с помощью роботизированной системы. Двенадцать точечных серийных разведений с коэффициентом разбавления 3,16 анализировали в 96-луночных планшетах с реакционным объемом 150 мкл. Рост клеток регистрировали как оптическую плотность при 600 нм, используя планшет-ридер Beckman DTX880 с многомодовым программным обеспечением v3.3.09. Растворы, содержащие диметилсульфоксид (ДМСО), были нормализованы до 2%. Значения IC ₅₀ были рассчитаны с использованием данных n = 2 и соответствия кривой логистической регрессии, созданной с помощью GraphPad Prism (GraphPad Software, Сан-Диего, Калифорния, США).

Хемогеномное профилирование

Ростовую активность тестируемых веществ определяли с использованием дикого типа S. cerevisiae BY4743. Значения OD ₆₀₀ экспоненциально растущих культур S. cerevisiae в богатой среде регистрировали с помощью роботизированной системы, и оптическую плотность измеряли при OD 600 на планшет-ридере Beckman DTX880 с многомодовым программным обеспечением для обнаружения v3.3.09. Двенадцатиточечные серийные разведения анализировали в 96-луночных планшетах с реакционным объемом 150 мкл. Растворы, содержащие диметилсульфоксид (ДМСО), были нормализованы до 2%. Значения IC ₃₀ были рассчитаны с использованием аппроксимации кривой логистической регрессии, созданной с помощью TIBCO Spotfire Spotfire 7.9–10.3 (TIBCO Software Inc).

Было выполнено профилирование гаплонедостаточности (HIP) и гомозиготное профилирование (HOP) Saccharomyces , а также анализ микрочипов, как опубликовано ранее ²² .Основная концепция этого анализа заключается в том, что HIP идентифицирует гены, в которых одна функциональная копия по сравнению с двумя придает гиперчувствительность к ингибированию соединением. Это указывает на пути, на которые непосредственно влияет соединение. HOP (обе копии гена удалены) указывает на синтетическую летальность и выявляет пути компенсации для тех, на кого непосредственно воздействует соединение. Таким образом, были приобретены библиотеки гетеро- и гомозиготных делеций по всему геному для штаммов S. cerevisiae (OpenBiosystems, № по каталогу YSC1056 и YSC1055), и пулы были сконструированы, как опубликовано ранее ²² .Каждый штамм HIP является гетерозиготным, и каждый штамм HOP полностью нулевой для одного гена (и каждый штамм идентифицируется уникальной последовательностью ДНК, называемой «штрих-кодом» или «меткой», вставленной в удаленный ген). Для каждого эксперимента с HIP и HOP каждое тестируемое вещество анализировали в двух экземплярах (2 лунки) при его концентрации IC ₃₀ в 24-луночных планшетах (Greiner 662102) с 1600 мкл / лунку YPD. ДМСО был нормализован до 2%. В начале эксперимента HIP ~ 250 дрожжевых клеток / штамм (100 мкл 1,5 OD ₆₀₀ / мл культуры) из прекультуры в фазе ночного журнала, куда добавляли лунки, содержащие соединение и ДМСО.Планшеты инкубировали в течение 16 ч в роботизированном инкубаторе со встряхиванием при 30 ° C / 550 об / мин, что позволяло сделать ~ 5 удвоений. В целом, ~ 250 дрожжевых клеток / штамм (120 мкл культуры 1,2 OD ₆₀₀ / мл) впоследствии были перенесены в новый 24-луночный планшет. После инокулирования новый планшет инкубировали при 30 ° C / 550 об / мин, чтобы позволить следующим 5 поколениям дрожжей (поколение 6–10). Эту процедуру повторяли еще 2 раза, пока последний планшет, содержащий дрожжи с ~ 20 поколениями, не хранился при 4 ° C. Анализ HOP выполняли аналогично эксперименту HIP, но его продолжительность была сокращена до 16 ч / ~ 5 удвоений, и, таким образом, не было необходимости в обратных разбавлениях.Перед экспериментом аликвоты пула HOP размораживали и восстанавливали в течение 3 часов в YPD, затем ~ 320 дрожжевых клеток / штамм (110 мкл культуры 1,5 OD ₆₀₀ / мл) переносили в каждую лунку. Клеточный материал из последних планшетов HIP и HOP собирали, гДНК экстрагировали и метки амплифицировали, как опубликовано ранее ²² . Затем относительное количество каждого штамма в лунках, обработанных соединением, сравнивали с восемью контрольными образцами без лекарственного средства, которые были получены в том же эксперименте.

Для экспериментального анализа мы использовали то же вычисление нормализованных интенсивностей тегов, маскирования выбросов и коррекции насыщенности, как опубликовано ранее ^22,41 . Чувствительность рассчитывалась как среднее логарифмическое значение абсолютного отклонения (MADL) для каждой комбинации соединение / концентрация, затем генные оценки z , основанные на надежной параметрической оценке вариабельности гена из> 3000 различных профилей, допускающих до 15% выбросы были вычислены, как подробно описано ²² .Профили визуализировались с помощью TIBCO Spotfire 7.9–10.3.

Селекция лекарственно-устойчивых

S. cerevisiae

Штамм BY4743∆8, производный от BY4741, но удаленный по восьми генам, участвующим в лекарственной устойчивости (оттокные насосы: SNQ2, PDR5 и YOR1 ; факторы транскрипции: PDR1, PDR2, PDR3, YAP1 и YRM1 ) инкубировали в 2,5% этилметансульфонате до тех пор, пока только 50% клеток не образовали колонии. Всего 2 × 10 ⁷ мутагенизированных клеток высевали на две 14-сантиметровые чашки с синтетической полной средой (0.7 г / л азотного основания дрожжей Difco без аминокислот, 0,79 г / л смеси аминокислот MPbio CSM и 2% глюкозы), содержащего 500 нМ джавсамицина. Через 4 дня можно было выделить устойчивые колонии и подтвердить устойчивость путем повторного анализа на селективной среде. Выделение геномной ДНК, секвенирование всего генома и целенаправленное секвенирование для подтверждения результатов были выполнены, как опубликовано ²² . Мутации клонировали в немутагенизированные клетки дикого типа, а устойчивость к складчатости по сравнению с диким типом оценивали тестированием зависимости реакции от дозы.

Тестирование цитотоксичности клеток млекопитающих

Воздействие на клетки млекопитающих HCT116 (CCL-247, ATCC) исследовали путем тестирования серийно разведенных соединений в 384-луночных планшетах, засеянных 750 клетками на лунку в среде DMEM с высоким содержанием глюкозы, глутамакса, пирувата (31^{7 , Life Technologies). ДМСО был нормализован до 0,2%. Жизнеспособность определяли, следуя протоколу CellTiter-Glo (G7573, Promega) после 96-часовой обработки соединением.}

50% раствор хлорида бензалкония (63249, Sigma Aldrich) использовали в качестве цитотоксического, положительного контроля и контроля полного ингибирования.Этот реагент был выбран, так как он недорогой, стабильный, дает крутые кривые ингибирования, не мешает большому диапазону считывания и безопасен в обращении. Анализ цитотоксичности / пролиферации WST-1 выполняли в соответствии с инструкциями производителя (Roche Cat # 11 644 807 001) для тестирования соединений на ингибирование роста в течение 72 часов в 3 линиях клеток млекопитающих: HEK293 (CRL11268, ATCC), K562 (CCL-243). , ATCC) и HEPG2 (HB-8065, ATCC). Эффекты на PIG-A и GPI-заякоренные белки тестировали с помощью анализа FLAER ²⁹ следующим образом: 50 000 клеток / лунку высевали в 6-луночный планшет и инкубировали на следующий день ± джавсамицин.После 4 дней обработки клетки разделяли и окрашивали с использованием разведения 1: 100 реагента FLAER (проаэролизин FLAER Alexa Fluor 488, FL2S, Cedarlanelabs) в PBS + 3% BSA в течение 20 минут. Для генетического нарушения PIG-A мы использовали стабильно экспрессирующую клеточную линию Cas9 HCT116 и трансдуцировали ее лентивирусной конструкцией, кодирующей sgRNA. Часть crРНК содержала следующую последовательность против PIG-A : TGGCGTGGAAGAGAGCATCA, и в качестве контроля была использована sgRNA, содержащая не нацеливающую последовательность crRNA: GTAGCGAACGTGTCCGGCGT.Чтобы сделать возможным редактирование и истощение белка, клетки анализировали через 11 дней после трансдукции и окрашивали, как описано выше. Клетки анализировали на BD FACSAria Fusion с использованием FACSDiva 8.0.1 и FlowJo 10.1r1. Было зарегистрировано 10 000 событий. Для тестирования эффекта джавсамицина необработанные и неокрашенные клетки использовались для установки ворот для отрицательных событий. Необработанные, окрашенные FLAER клетки использовали для установки ворот для положительных событий. В эксперименте по генетическому контролю окрашенные FLAER клетки с нецелевой sgRNA использовали для установки ворот для положительных событий, а неокрашенные клетки использовали в качестве отрицательного контроля.Исходные данные и изображения настроек ворот представлены в файле исходных данных.

Противогрибковые испытания

Тесты на чувствительность к противогрибковым препаратам проводились в соответствии с рекомендациями Института клинических и лабораторных стандартов (CLSI) для микроразведений бульонов M27-A3 (дрожжи) и M38-A2 (плесень) в RPMI 1640 (HyClone; Sh40011.03) с 2,05 мМ глутамина и фенолового красного, без бикарбоната, забуференные 0,165 M MOPS [3- ( N -морфолино) пропансульфоновая кислота] (Appli-Chem; A1076,0250) до pH 7.0.

Штаммы-продуценты и кластер биосинтетических генов

Образец джавсамицина (FR-8) в скрининговом блоке был аннотирован как производный от штамма Streptomyces luteoverticillatus в нашей коллекции штаммов. Наши записи описывают, что штамм был выделен из образца почвы в Китае, провинция Ухань и добавлен в коллекцию Novartis в рамках сотрудничества в 2004 году. Секвенирование Ilumina Streptomyces luteoverticillatus выявило общий размер генома 7.84 Мбит / с. Поиск BLAST позволил идентифицировать кластер биосинтетических генов (BGC) джавсамицина. Опубликованный Jawsamycin BGC (номер доступа AB8) показывает чрезвычайно высокое сходство на аминокислотном уровне при сравнении с последовательностью, полученной из нашего внутреннего штамма (средняя аминокислотная идентичность 99,6%) ²⁰ . Полученная последовательность кластера биосинтетических генов, включая некоторую фланкирующую последовательность, может быть найдена в файле исходных данных и депонирована в нуклеотидной базе данных GenBank с регистрационным номером MT553334.Этот штамм впоследствии был использован для дальнейшего получения джавсамицина, как описано в следующих разделах.

Оптимизация сред и ферментация

Штамм-продуцент культивировали при 28 ° C в течение 7 дней при встряхивании во встряхиваемых колбах и титры джавсамицина количественно определяли с помощью UPLC-UV. Среда 300-04.00, состоящая из агара (Bacto) 1 г / л, глицерина 1 г / л, NaCl 0,05 г / л, CaCO ₃ 0,05 г / л, KH ₂ PO ₄ 0,25 г / л, К ₂ HPO ₄ 0.5 г / л, MgSO ₄ 0,1 г / л, дрожжевой экстракт 1,35 г / л, NZ-амины 2,5 г / л, солодовый экстракт 5,85 г / л, моногидрат 1-аспарагина 1 г / л, соевый белок (Unico 75 ) 2,5 г / л, картофельный крахмал (Noredux A150) 7,5 г / л, церлоза 7,5 г / л, HEPES 6 г / л, исходный раствор микроэлементов 1 мл / л), а с титром 2,2 мг / л чавсамицин был выбран для начального брожения и в качестве отправной точки для оптимизации среды. Для оптимизации производственной среды экспериментальный план Плакетта-Бермана был применен в качестве первой меры, чтобы идентифицировать компоненты среды, которые являются наиболее важными для производства чавсамицина.Наибольшее положительное влияние компонентов среды наблюдалось для картофельного крахмала, солодового экстракта, дрожжевого экстракта и KH ₂ PO ₄ . Эти компоненты были выбраны для дальнейшей оптимизации в центральном эксперименте по составному дизайну. Всего было приготовлено 25 различных вариантов, которые использовали для культивирования с последующим количественным определением джавсамицина. Оптимизированная среда 300–30.00, состоящая из агара (Bacto) 1 г / л, глицерина 7,5 г / л, NaCl 0,05 г / л, CaCO ₃ 0,05 г / л, KH ₂ PO ₄ 0.5 г / л, K ₂ HPO ₄ 1 г / л, MgSO ₄ 0,1 г / л, дрожжевой экстракт 15 г / л, NZ-амины 2,5 г / л, солодовый экстракт 15 г / л, л моногидрат спарагина 1 г / л, соевый белок (Unico 75) 2,5 г / л, картофельный крахмал (Noredux A150) 20 г / л и церелоза 7,5 г / л, HEPES 6 г / л) и исходный раствор микроэлементов 1 мл / л, что дает титр джавзамицина 10,3 мг / л во встряхиваемых колбах. Та же среда, но без агара, использовалась для ферментации в масштабе 3700 литров. Всего в 3500 литров среды засевали 200 литров посевной культуры и культивировали в течение 5 дней при 28 ° C.PH контролировали на уровне pH 7 ± 0,2 с помощью H ₂ SO ₄ и NaOH, а pO ₂ контролировали при 40% насыщении с помощью скорости мешалки. Через 5 дней ферментации были собраны со средним титром 4–5 мг / л.

Экстракция и выделение

Во время сбора урожая ферментационные бульоны доводили до pH 5,5 и экстрагировали равными объемами этилацетата. Фазы разделяли на сепараторе Westphalia SB21. Органический слой упаривали и полученное вязкое масло суспендировали в смеси метанол / вода 9: 1 и экстрагировали циклогексаном для удаления липидов.Циклогексан удаляли, а фазу метанол / вода экстрагировали еще два раза циклогексаном. Метанол выпаривали и водный слой экстрагировали этилацетатом. Количество экстрактов, полученных по этой методике из крупномасштабных ферментаций, находилось в диапазоне 900 г – 1 кг. Неочищенные экстракты разделяли последовательными хроматографическими стадиями. Первоначальное разделение проводили с помощью крупномасштабной препаративной ВЭЖХ (RP18 YMC ODSA SP, 5–15 мкм, 200 × 700 мм). В качестве подвижных фаз использовались вода и метанол с добавлением 0.1% муравьиная кислота. Скорость потока составляла 500 мл / мин, и градиент начинался при 50% -ном метаноле, поддерживаемом постоянным в течение 10 минут, с последующей стадией градиента до 65% -ного метанола и изократическим элюированием в течение 50 минут. За этим следовала еще одна стадия градиента до 75% метанола и дальнейшее изократическое элюирование до завершения разделения и очистки колонки 100% метанолом. При приготовлении первой пробы для инъекции в 50% метаноле и 50% воде наблюдался осадок, который, как оказалось, состоял в основном из джавсамицина.Поэтому неочищенный экстракт растворяли в 50% метаноле и 50% воды, концентрировали упариванием и хранили при 4 ° C в течение ночи. Полученный осадок получали фильтрованием и приводили к значительному обогащению джавсамицином, который подвергали разделению, как описано выше. Окончательную очистку проводили препаративной ВЭЖХ на колонке Sunfire-C18 (5 мкм, 30 × 150 мм, Waters). В качестве подвижных фаз использовались вода и ацетонитрил с добавлением 0,1% муравьиной кислоты. Скорость потока составляла 60 мл / мин, и градиент начинался с 50% ацетонитрила, который оставался постоянным в течение 1.5 мин с последующим линейным градиентом от 1,5 до 17 мин от 50 до 70% ацетонитрила с последующей промывкой и повторным уравновешиванием колонки. Фракции, содержащие соединение, концентрировали при пониженном давлении с последующим замораживанием и лиофилизацией. В зависимости от предполагаемого назначения материала (исходный материал для полусинтеза, исследования in vitro или исследования in vivo) джавсамицин очищали до 85–99% чистоты по данным UPLC-UV-CAD-MS и ЯМР.

Всего было проведено несколько ферментаций объемом от 20 до 100 л и 3 ферментации в масштабе 3700 л и 33 комбинированных.Было очищено 2 г джавсамицина.

Химическая дериватизация джавсамицина

Подробные протоколы дериватизации джавсамицина см. В разделе «Дополнительные методы» в документе «Дополнительные данные», представленном в качестве онлайн-приложения.

Модель мукормикоза на мышах и тестирование противогрибковой эффективности

Модель мукормикоза проводили, как описано ранее ³² . Мыши-самцы ICR (20-25 г) были приобретены в Taconic (Germantown, NY) и содержались группами по пять мышей в каждой.Им давали облученный корм и стерильную воду, содержащую 50 мкг / мл Байтрила (Байера) ad libitum. Иммуносупрессию мышей подавляли циклофосфамидом (200 мг / кг, вводимым внутрибрюшинно) и ацетатом кортизона (500 мг / кг, вводимым SQ) в дни -2, +3 и +8 относительно инфекции. Этот режим лечения приводит к лейкопении в течение ~ 16 дней, при этом общее количество лейкоцитов падает с ~ 13000 см ³ до почти полного отсутствия лейкоцитов, как определено системой Unopette (Becton-Dickinson and Co.). Для предотвращения бактериальной инфекции в питьевую воду добавляли 50 мкг / мл энрофлоксацина (Байтрил; Байер, Леверкузен, Германия) с дня -3 до дня 0. Цефтазидин (Cfz, 5 мкг / доза / 0,2 мл) заменял лечение энрофлоксацином в день. 0 и вводили ежедневно подкожной инъекцией с 0 по 6 день (тканевая грибковая нагрузка) или 13 дня (выживаемость).

Интратрахеальную инстилляцию спор R.delemar проводили модификацией метода Luo и соавторов ³² .Вкратце, при оттягивании языка мышей, подвергнутых анестезии изофлурановым газом, кпереди в сторону с помощью щипцов, 25 мкл спор грибов (2,5 × 10 ⁵ клеток) в PBS вводили через голосовые связки в трахею с загрузкой геля Фишербранда наконечник (каталожный номер 02-707-138). Чтобы подтвердить, что инокулят доставлен в легкие, двух или трех мышей умерщвляли сразу после заражения, легкие вскрывали, гомогенизировали и количественно культивировали на чашках с КПК плюс 0,1% тритона. Подсчет колониеобразующих единиц (КОЕ) проводили после инкубации при 37 ° C в течение 24 часов.После заражения мышей случайным образом распределяли по различным экспериментальным группам. Неинфицированным контрольным мышам интратрахеально вводили 25 мкл PBS.

Для тестирования противогрибковой эффективности джавсамицина соединение составляли в виде суспензии наночастиц в 1% гидроксипропилцеллюлозе (HPC) / 0,1% Tween 80 и вводили через желудочный зонд в суточной дозе 30 или 100 мг / кг один раз в день (QD). . В качестве активной группы сравнения пероральная суспензия позаконазола вводилась через желудочный зонд в суточной дозе 60 мг / кг 1 раз в сутки.Инфицированные необработанные контрольные мыши (плацебо) получали 1% HPC / 0,1% Tween 80. Терапия была начата через 16 часов после грибковой инфекции и проводилась в течение 7 или 11 дней. Время до заболеваемости у умирающих мышей, гуманно умерщвленных, служило конечной точкой и отслеживалось в течение 21 дня после заражения.

В отдельных экспериментах лечение препаратами начинали через 16 часов после заражения, как указано выше, и продолжали до +6 дня после заражения. Мышей умерщвляли на +7 день, легкие и мозг вырезали и обрабатывали для определения грибковой нагрузки на ткани с помощью кПЦР в реальном времени, как описано ранее ³² .Данные о грибковой нагрузке на ткани были представлены в виде эквивалента Log10 КОЕ / грамм ткани.

Для исследований выживаемости 10 мышей / группа обеспечат не менее 80% мощности для проверки отношения рисков 0,2 или более с уровнем значимости p = 0,025 с использованием теста логарифмического ранга и пропорциональной модели Кокса (односторонний тест) предполагая 100% и 50% смертность в контрольной и обработанной группах соответственно. Что касается бремени тканевых патогенов, 10 мышей на группу обеспечат не менее 90% мощности для обнаружения величины эффекта 3 или 3 SD разницы в КОЕ (выраженных в логарифмическом масштабе) с помощью двух проб t -тест с α , равным 0.05, предполагая, что стандартное отклонение для обработанной группы вдвое больше, чем для контрольной группы. Два образца t -тест и ANOVA были использованы с апостериорным анализом с использованием методов коррекции Тьюки для контроля общего коэффициента ошибок типа 0,05. Для всех сравнений вычислялись медиана (межквартильный размах) и 95% доверительный интервал. Все анализы данных проводились с использованием GraphPad Prism 6. p <0,05 считались значимыми.

Все процедуры исследования, связанные с животными, соответствовали Закону о благополучии животных, Руководству по уходу и использованию лабораторных животных и Управлению по благополучию лабораторных животных и проводились в соответствии с протоколом, утвержденным IACUC Институтом Лундквиста в Харбор-Калифорнийский университет в Лос-Анджелесе Центр.

Сводка отчетов

Дополнительная информация о дизайне исследования доступна в Сводке отчетов по исследованиям природы, связанной с этой статьей.

Противогрибковый потенциал вторичных метаболитов, участвующих во взаимодействии между патогенами цитрусовых

MSI выявляет потенциальные противогрибковые средства во взаимодействии между

P. digitatum и P. citrinum

Для скрининга новых противогрибковых соединений с потенциалом защиты цитрусовых и борьбы с послеуборочными заболеваниями мы применили стратегию совместного культивирования с участием P.digitatum и другой патоген цитрусовых, P. citrinum . Совместное культивирование — это стратегия, вдохновленная природой, в которой конкуренция между микроорганизмами может вызвать производство новых метаболитов ⁸ . В предыдущей работе совместное культивирование между Trichophyton rubrum и Bionectria ochroleuca индуцировало продукцию нового сульфатированного аналога PS-990, предполагая, что это соединение дополнительно сульфатируется во время грибкового взаимодействия ²⁶ .Кроме того, другим примером соединения, полученного в результате взаимодействия с грибами, является тетрапептид цикло- ( _L -лейцил- транс -4-гидрокси- _L -пролил- _D -лейцил- транс -4-гидрокси — _L -пролин), выделенный из бульона для совместного культивирования Phomopsis sp. K38 и Alternaria sp. E33; циклический тетрапептид проявлял ингибирующую активность от умеренной до высокой в ​​отношении фитопатогенных грибов по сравнению с коммерческим фунгицидом триадимефоном ²⁷ .Таким образом, эксперименты по совместному культивированию представляют собой жизнеспособный подход для поиска соединений, которые могут ингибировать основные фитопатогены цитрусовых, особенно зеленую плесень, вызываемую P. digitatum .

При совместном культивировании как в апельсиновой ( in vivo, ), так и в синтетической среде ( in vitro ) мы визуально наблюдали подавление роста на больших расстояниях между P. citrinum и P. digitatum . Во взаимодействии с грибами могут активироваться молчащие гены, и вредные метаболиты могут распространяться от одного партнера к другому ^16,28 .Эти индуцированные метаболиты обычно локализуются в зоне конфронтации в твердых средах совместных культур ¹⁶ . Однако обычные подходы, используемые для обнаружения и выяснения метаболитов, такие как масс-спектрометрия в сочетании с жидкостной (ЖХ-МС) или газовой (ГХ-МС) хроматографией, не предоставляют информации о пространственном распределении молекул ²⁹ .

Информация о пространственном распределении молекул может быть получена с помощью масс-спектрометрической визуализации (MSI), мощного инструмента, который генерирует изображения для каждого иона, обнаруженного в масс-спектре ¹⁶ .Использование MSI для понимания микробных систем и их вторичных метаболитов не ново, и исследования, в которых этот метод был успешно применен, можно найти в литературе ³⁰ . Например, MSI был применен для исследования взаимодействия между Bacillus subtilis 3610 и Streptomyces coelicolor A3. Визуализация совместной культуры бактерий с помощью DESI выявила 57 сигналов, пространственно локализованных в бактериальных колониях, что привело к идентификации некоторых вторичных метаболитов, таких как сурфактин и плипастатин ³¹ .Кроме того, анализ MSI также показал, что S. coelicolor имеет продукцию определенных вторичных метаболитов, ингибированных в присутствии B. subtilis , что свидетельствует о взаимодействии между бактериями ³¹ .

Таким образом, для обнаружения вторичных метаболитов, участвующих во взаимодействии между патогенами цитрусовых, мы наносили DESI-MSI непосредственно на поверхность агара для совместной культуры, чтобы визуализировать диффузию соединений в зону конфронтации. Сигналы MSI были получены для ионов [M + H] ⁺ при m / z 519.1857, m / z 503.1908, m / z 475.1590, m / z 460.1960, m / z 459.1645, m / z 625.3942, m / z 609.3988, 52.27.2 , m / z 511.2894 и m / z 448.2938 (рис. S1 – S10). Мы наблюдали, что все указанные ионы были обнаружены и сконцентрированы в зоне противостояния грибов (рис. 1). Эти соединения могут быть связаны с взаимодействием грибов и грибов и могут быть потенциально новыми противомикробными средствами.Ионы с m / z 625, 609, 527, 511 и 448 были произведены P. citrinum , в то время как ионы с m / z 519, 503, 475, 460 и 459 казались контратакой. из P. digitatum , что свидетельствует о химической войне между этими двумя патогенами цитрусовых. Ионы, обнаруженные in vitro с помощью анализов MSI, также были обнаружены в экстрактах совместных культур in vivo (фиг. S11 – S20) с использованием апельсинов в качестве субстрата (фиг. 2).

Рисунок 1

Визуализирующий анализ совместного культивирования патогенов цитрусовых с помощью (+) DESI-MS.Каждое изображение MS показывает пространственное распределение отношения m / z по поверхности совместного культивирования. Все изображения нанесены на одну и ту же цветовую шкалу от 0 (черный) до 2 × 10 ⁵ (красный), однако концентрацию ионов нельзя сравнивать на изображениях, поскольку различия в химической структуре могут привести к изменению эффективности ионизации ³⁰ .

Рисунок 2

Обзор экспериментальной установки и стратегий, применяемых для анализа вторичных метаболитов, участвующих во взаимодействии патогенов цитрусовых. P. digitatum и P. citrinum совместно культивировали в апельсине ( in vivo, ) и в среде PDA ( in vitro, ) для индукции продукции вторичных метаболитов. Применяли MSI, in vitro , для обнаружения вторичных метаболитов, продуцируемых в зоне конфронтации. HRMS-анализ выполняли для подтверждения взаимодействия грибок-гриб in vivo . Представляющие интерес метаболиты были выделены в ходе масштабного эксперимента. Впоследствии были выполнены противогрибковые анализы и анализ с конфокальной лазерной сканирующей микроскопией для исследования антимикробной активности и морфологии грибковых клеток, соответственно.

Чтобы охарактеризовать метаболиты, участвующие во взаимодействии, экстракт совместного культивирования был получен в эксперименте по масштабному культивированию, а интересующие соединения, обнаруженные первоначально с помощью анализов MSI, были выделены препаративной ВЭЖХ и охарактеризованы с помощью тандемной масс-спектрометрии и ЯМР-анализов .

С помощью точных масс, полученных с помощью анализов DESI-MSI (таблица 1), можно было подтвердить присутствие индольных алкалоидов, продуцируемых P. digitatum . Ионы [M + H] ⁺ при m / z 519.1857, m / z 503.1908, m / z 475.1590, m / z 460.1960 и m / z 459,1645, которые соответствуют триптоквиаланину A ( 1 ), триптоквиаланину C ( 1 ), триптохвиаланину C (), триптохианону 2 2ptoquial ( 3 ), 15-диметил-2-эпифумихиназолин A ( 4 ) и дезокситриптоквиаланон ( 5 ) (химические структуры представлены на рис. 3). Эти соединения являются частью пути биосинтеза триптоквиаланинов ³² и были ранее обнаружены в ходе анализа DESI-MSI апельсинов, инфицированных болезнью зеленой плесени ²³ .

Таблица 1 Данные DESI-MSI, полученные для вторичных метаболитов, участвующих во взаимодействии P. digitatum и P. citrinum . Рисунок 3

Химическая структура индольных алкалоидов, продуцируемых P. digitatum : триптоквиаланин A ( 1 ), триптоквиаланин C ( 2 ), триптоквиаланон ( 3 ), 15-диметил-2-2-диметил-2. фумихиназолин А ( 4 ) и дезокситриптоквиаланон ( 5 ). Эти соединения были обнаружены с помощью DESI-MSI в зоне грибковой конфронтации.

Соединение 1 было зарегистрировано как основной вторичный метаболит, продуцируемый P. digitatum ³³ . Тем не менее, делеция гена tqaA , ответственного за регуляцию биосинтеза 1 , показала, что 1 не участвует в патогенности P. digitatum против цитрусовых, поскольку инфекционная способность мутантов не изменилась ³⁴ . Точная биологическая роль триптоквиаланинов все еще неизвестна ³⁴ , и это исследование обеспечивает новую биологическую активность триптоквиаланинов с участием этих алкалоидов во взаимодействии между грибами и грибами.

МС / МС иона [M + H] ⁺ при m / z 625,3951 дало фрагменты при m / z 594,3533, 576,3427, 449,2430 и 431,2325 (рис. S21), та же картина фрагментации получен для цитринадина А ( 6 ) в исследовании, включающем совместное культивирование между P. citrinum и Pseudoalteromonas sp . ОТ59 ¹⁹ . Также база данных GNPS предполагает, что ион с m / z 625 может быть цитринадином А. Тандемный масс-спектр, полученный для этого соединения, имеет пять общих фрагментов с тандемным масс-спектром 6 , депонированным в базе данных (рис.S22). Кроме того, он имеет сходный образец фрагментации MS / MS с цитринадином A, о котором сообщают Moree et al . (2014). Сообщалось, что цитринадины в большей степени продуцируются в условиях совместного культивирования и концентрируются в границах раздела совместного культивирования, что свидетельствует об защитном ответе P. citrinum против других микроорганизмов ^19,35 .

Анализ молекулярной сети выделенных соединений показал, что во взаимодействие при совместном культивировании участвует другой цитринадин.Мы наблюдали, что ион при m / z 609, первоначально обнаруженный с помощью анализа MSI, сгруппирован в один и тот же кластер соединения 6 ( m / z 625) (рис. S23), что позволяет предположить, что это соединение является цитринадином. -подобный метаболит. В молекулярном сетевом анализе родственные метаболиты группируются в одни и те же кластеры, поскольку они имеют аналогичный спектр МС / МС ³⁶ .

Точная масса, полученная для иона [M + H] ⁺ при m / z 609,4010 соответствует соединению с молекулярной формулой C ₃₅ H ₅₃ N ₄ O ₅ .Схема фрагментации дала фрагменты с m / z 578,3583, 464,2905, 451,2586 и 433,2482 (дополнительный рисунок S24). Спектры ¹ H ЯМР и ¹ H- ¹ H COSY, полученные для очищенного метаболита (рис. S25 – S26 и таблица S1), показали аналогичные сигналы синтезированного дезоксицитринадина A, о чем сообщили Bian et al. . (2013) ³⁷ . Характеристический сигнал эпоксида при δ _H 4.0 у этой производной отсутствовал, а сигнал для винильного водорода можно было наблюдать при δ _H 6.9, что указывает на отсутствие эпоксидной группы и наличие двойной связи по сравнению с цитринадином A ³⁷ . Впервые дезоксицитринадин А ( 7 ) описывается в литературе как вторичный метаболит, продуцируемый микроорганизмом.

Точные массы, полученные DESI-MSI для ионов [M + H] ⁺ при m / z 527,2862 и 511,2894 указывают соединения с элементным составом C ₂₈ H ₃₈ N ₄ O ₆ и C ₂₈ H ₃₈ N ₄ O ₅ соответственно.МС / МС показала, что ион с m / z 511 имеет аналогичную структуру по сравнению с m / z 527, за исключением отсутствия атома кислорода. Фрагментация иона при m / z 527 привела к фрагментам m / z 281, 247, 219, 182 и 120 (рис. S27), а ион при m / z 511 привел к m / z . 265, 247, 219, 166 и 120 (рис. S30). Такой же характер фрагментации был зарегистрирован для последовательности тетрапептидов Phe-Val-Val-Tyr ( 8 ) из Penicillium canescens ³⁸ .Тем не менее, тетрапептиды 8 и Phe-Val-Val-Phe ( 9 ) недавно были описаны как вторичные метаболиты, продуцируемые Penicillium roqueforti ³⁹ . ¹ H и ¹³ C ЯМР-анализы выделенных соединений (рисунки S28 – S32 и таблицы S2-S3) подтвердили результаты, полученные с помощью MS / MS, заключая, что ионы при m / z 527 и m / z 511 соответствуют 8 и 9 соответственно. Производство этих тетрапептидов при химической войне против грибков неудивительно, поскольку малые пептиды известны своей антимикробной активностью ⁴⁰ .Это первое сообщение о 8 и 9 в качестве вторичных метаболитов P. citrinum .

Для иона [M + H] ⁺ при m / z 448,2938, точная масса предполагает соединение с молекулярной формулой C ₂₈ H ₃₈ N ₃ O ₂ , такой же состав вторичный метаболит хризогенамид A ( 10 ) (ошибка = -4,6 ppm). Соединение 10 было выделено и анализом ЯМР ¹ H и ¹³ C (фиг.S33 – S34 и таблица S4) подтвердили его структуру; это первое сообщение о том, что хризогенамид А участвует во взаимодействии грибков и грибов. Соединение 10 впервые было описано как вторичный метаболит Penicillium chrysogenum № 005, эндофитного гриба, связанного с растением Cistanche deserticola ⁴¹ . Также сообщалось, что 10 является вторичным метаболитом штамма P. citrinum ⁴² . Структуры метаболитов, продуцируемых P.citrinum представлены на рис. 4.

Рисунок 4

Химические структуры вторичных метаболитов, продуцируемых P. citrinum во время химической войны против P. digitatum : цитринадин A ( 6 ), дезоксицитринадин A ( 7 ) и хризогенамид А ( 10 ).

Противогрибковые анализы

Мы исследовали противогрибковую активность метаболитов, продуцируемых в совместной культуре, и P. digitatum инокулировали в агаризованную среду, содержащую экстракт совместной культуры.По сравнению с контролем, мы наблюдали уменьшение на 67% радиального роста P. digitatum (рис. S35) на 67%, что указывает на то, что метаболиты, участвующие в грибковой войне, могут выступать в качестве противогрибковых агентов. Чтобы подтвердить эту гипотезу, мы протестировали выделенные соединения и обнаружили, что соединения 6 , 9 и 10 (400 мкг мл ^-1 ) уменьшали 48%, 41% и 61% радиального рост соответственно по сравнению с контролем (рис. 5), подтверждающий противогрибковую активность.

Рисунок 5

P. digitatum , растущий на КПК с 400 мкг мл ^-1 ( A ) хризогенамида A ( B ) цитринадина A и ( C ) тетрапептида Phe-Val-Val- Phe. Через 96 ч наблюдается ингибирование радиального роста в присутствии изолированных метаболитов по сравнению с контролем ( D ).

Было обнаружено, что цитринадины участвуют в реакции P. citrinum против других микроорганизмов в совместных культурах, но их биологическая роль в биологической среде до сих пор неизвестна ¹⁹ .Соединение 6 было протестировано на активность против язвы бурули на Mycobacterium ulcerans MN209, но не наблюдалось интересной МИК ⁴³ ; также сообщалось о цитотоксической активности 6 против клеток лейкемии и карциномы ⁴⁴ . Наши результаты являются первым сообщением об антимикробной активности цитринадинов в литературе и могут дать первое представление о биологической роли этих соединений во взаимодействиях между грибами и грибами.

Кроме того, до сих пор о хризогенамиде А не сообщалось как о противомикробном средстве.Соединение 10 проявляло защитный эффект на нейроциты против вызванной окислительным стрессом гибели клеток ⁴¹ , однако никакой другой биологической активности для 10 в литературе не сообщалось.

Противогрибковые анализы с применением _D -Phe- _L -Val- _D -Val- _L -Tyr показали, что этот тетрапептид обладает ингибирующей активностью против B. subitllis и фитопатогена сои Fusarium virguliforme. 38 .Напротив, отсутствие ингибирования E. coli , B. subtilis и S. cerevisiae в присутствии _D -Phe- _L -Val- _D -Val- _L -Tyr или _D -Phe- _L -Val- _D -Val- _L -Phe наблюдалось ³⁹ .

Была также оценена противогрибковая активность триптоквиаланинов, поскольку эти соединения, по-видимому, являются химической реакцией P. digitatum против P.citrinum в химической войне. Триптоквиаланины 1 и 4 были протестированы и выявили противогрибковую активность против P. citrinum . Соединения 1 и 4 имели MIC 300 мкг / мл ^-1 , ингибируя образование спор P. citrinum (фиг. S36). Насколько нам известно, это первое сообщение об антимикробной активности триптоквиаланинов. Недавно 1 было продемонстрировано как инсектицидное соединение против Ae.aegypti larvae ²³ ; Противогрибковая активность может обеспечить лучшее понимание роли триптоквиаланинов в среде патогенов цитрусовых, если эти соединения не требуются для вирулентности P. digitatum ³⁴ .

Химическая война изменяет

клеточную стенку P. digitatum при совместном культивировании

Для исследования действия вторичных метаболитов во время грибкового взаимодействия образцы совместного культивирования окрашивали конго красным и наблюдали с помощью конфокальной лазерной сканирующей микроскопии.Конго Красный обычно используется для окрашивания полисахаридов, содержащих связи β 1,4, как, например, хитин, составляющий клеточную стенку грибов, ^45,46 . гиф P. digitatum наблюдали в зоне конфронтации (образец) и сравнивали с гифами, удаленными от области интерфейса (контроль) (рис. S37). Контрольные гифы были гомогенно окрашены Конго красным, в то время как гифы в области интерфейса демонстрировали измененную картину окрашивания (фиг. 6) с нерегулярными пятнами. Сходные паттерны окрашивания были получены для грибов с нокаут-мутантами, у которых удаленные гены играли роль в организации клеточной стенки; в результате мутанты проявляли дефектные клеточные стенки и нерегулярное окрашивание ^25,46,47 .Тем не менее, аномальное окрашивание Calcofluor White наблюдалось для P. ostreatus P89, обработанных при 36 ° C; высокая температура изменила распределение хитина и целостность клеточной стенки ⁴⁸ .

Рисунок 6

Конфокальная лазерная сканирующая микроскопия Congo Red P. digitatum гиф ( A ) удаленных от P. citrinum и ( B ) в зоне конфронтации. Пятна конго красного указывают на дефектную клеточную стенку грибка. Баров = 5.0 мкм.

Эти данные показывают, что гиф P. digitatum при контакте с метаболитами, диффундирующими во время совместного культивирования, имеют дефектную клеточную стенку, поскольку Конго Красный связывается со структурами клеточной стенки грибов. Клеточная стенка грибов является привлекательной мишенью для противомикробных препаратов, поскольку они не присутствуют в клетках млекопитающих ^49,50 . В заключение, микроскопический анализ и противогрибковые анализы подтверждают, что метаболиты, участвующие в грибковом взаимодействии, имеют потенциал как противогрибковые агенты и могут быть механизмом в природе, который эти фитопатогены вырабатывают, чтобы конкурировать с другими микроорганизмами за хозяина (рис.7).

Рис. 7

Химическая война между P. citrinum и P. digitatum в цитрусовых. Триптоквиаланины, цитринадины, хризогенамид А, тетрапептиды и другие метаболиты участвуют в наблюдаемом удаленном ингибировании.

ГЕННАЯ КОНСТРУКЦИЯ ДЛЯ ОБНАРУЖЕНИЯ ПРОТИВООПУХОЛЕЙ И ПРОТИВОПОГБОЧНЫХ СОЕДИНЕНИЙ

Рис. 1. Диаграмма, показывающая, как цепь генетической амплификации и обратной связи маршрута CWI опосредована MAPK Slt2 в S.cerevisiae. Показаны различные компоненты, вовлеченные в этот путь, ответ на стресс клеточной стенки, и состав генной конструкции по изобретению.

Была разработана генная конструкция с генами из Saccharomyces cerevisiae , которая может обнаруживать противогрибковые и противоопухолевые соединения благодаря своей способности изменять клеточную стенку грибов или ингибировать компоненты, участвующие в передаче сигналов через путь MAPK, ответственных за поддержание Целостность клеточной стенки (CWI).

Генная конструкция включает ген MKK1 из Saccharomyces cerevisiae , в котором точечная мутация приводит к изменению аминокислоты 386 белка (серин на пролин), создавая гиперактивную форму белка (MKK1 ^S386P ). Этот ген регулируется промотором индуцибельного гена фактора транскрипции Rlm1 из пути целостности клетки (активируется атаками на клеточную стенку), в частности геном pYKL161C ( MLP1 ) (имеющим высокую индукцию транскрипции в ответ на повреждение стенки и стимулы, которые активируют CWI) и последовательность терминации пути ADh2 гена транскрипции (рис. 1).

Такая генная конструкция усиливает ответ на сигналы, которые активируют путь целостности клетки, даже если они слабые, и включает создание цепи положительной обратной связи, стимуляция которой приводит к гибели клетки. Вызывая летальность, этот инструмент позволяет легко настраивать системы слежения за соединениями, используя простой, специфический, чувствительный и легкий способ манипулирования.

Технология подходит для биотехнологической и фармацевтической промышленности, в рамках программ скрининга лекарств для обнаружения соединений с противогрибковой активностью или модифицирующей активности сигнала, опосредованного MAPK или противоопухолевыми.

Эта технология защищена национальным патентом (ES2530292B2), выданным после предварительной экспертизы, и подана заявка на международное распространение (PCT / ES 2015/000166).

Генная конструкция может быть включена в вектор или в геном S. cerevisiae. На трансформантах, несущих генную конструкцию, можно проводить анализы для обнаружения соединений с противогрибковой или противоопухолевой активностью. Если эти вещества стимулируют путь целостности клетки, произойдет активация киназного каскада Slt2.Он будет вызывать фосфорилирование и активацию Rml1, индукцию промотора YKL161C и экспрессию гиперактивного аллеля (Рисунок 1). Схема усиления с положительной обратной связью будет генерироваться, пока сохраняется стимул, что приводит к чрезмерной реакции, приводящей к гибели клеток при низких концентрациях любого агента, который изменяет клеточную стенку (рис. 2). Это придает генной конструкции гиперчувствительность к стимулам, активирующим путь CWI.

Система может быть использована для идентификации следующих соединений:

Противогрибковые соединения:

Рисунок 2.Иллюстративные фотографии подавления роста, вызванного у S. cerevisiae диском, пропитанным конго красным, в диких клетках с генетической цепью усиления сигнала и без нее.

Это могут быть соединения, которые изменяют процессы клеточной стенки или непосредственно повреждают структуру. Эти соединения стимулируют цепь амплификации пути CWI, вызывая гибель клеток. Их можно было обнаружить с помощью системы слежения HTS (High Throughput Screening). Штамм, содержащий генную конструкцию, будет сверхчувствителен к повреждению клеточной стенки, и благодаря этому вы сможете обнаружить новые соединения, которые активны в отношении этой мишени, даже если они находятся в низких концентрациях или имеют пониженную мощность в тестируемом образце.

Они также могут быть идентифицированы как соединения, которые ингибируют компоненты пути CWI, предотвращая разрядку компенсаторного механизма, который активируется в условиях повреждения клеточной стенки, тем самым поддерживая целостность этой важной структуры. В комбинированной терапии эти соединения могут усиливать действие других противогрибковых препаратов, действующих на клеточную стенку. Эти соединения можно идентифицировать по их способности предотвращать гибель клеток грибковых штаммов, которые имеют генную конструкцию по изобретению, в условиях активации схемы амплификации любым известным способом стимулирования CWI.Поскольку форма идентификации заключается в отслеживании восстановления жизнеспособности клеток, предпочтение отдается выделению соединений с низкой токсичностью для эукариотических клеток.

Противоопухолевые соединения:

• Противоопухолевые соединения могут быть обнаружены с помощью биоанализа, описанного выше в разделе b. Действуя как ингибиторы компонентов пути CWI, соединения потенциально могут быть ингибиторами аналогичных путей MAPKs у млекопитающих. В этом случае мишень не будет специфичной для грибов, и соединения могут иметь противоопухолевый эффект, поскольку пути MAPKs важны для пролиферации клеток высших эукариотических клеток.

Эта технология обеспечивает очень простой и экономичный инструмент управления для компаний, ищущих противогрибковые или противоопухолевые препараты. Во-первых, что касается противогрибковых средств, эта генная конструкция может обнаруживать соединения, которые нацелены на клеточную стенку грибов, мишень, на которую еще не существует большого количества коммерческих противогрибковых средств, мишень, против которой не появилось большого количества резистентностей, что произошло с другими противогрибковыми средствами, действующими на другие цели. Поскольку структура, которой нет в клетках человека, они могут найти противогрибковые средства с меньшим количеством побочных или побочных эффектов.Кроме того, конструкция очень чувствительна из-за усиления ответа, способна обнаруживать соединения с противогрибковыми свойствами даже при очень низких концентрациях.

Что касается соединений с противоопухолевой активностью, генная конструкция может иметь вторую область применения из-за сходства MAPK с другими эукариотическими организмами, включая высшие организмы. Следовательно, соединения, идентифицированные как ингибиторы MAPK в гомологах дрожжей, также могут действовать на компоненты, присутствующие в клетках млекопитающих. »Патент

.

.	.	Каспофунгин .		Вориконазол .		CW-11 .
Виды / штамм .	Ген удален / аннотация .	микрофон .	MEC .	микрофон .	MEC .	микрофон .	MEC .
A. fumigatus
AF293	0,2
ΔEcm33	GPI-заякоренный организационный белок клеточной стенки AfuEcm33 20	> 12.5	0,2	1,6	0,4	> 12,5	0,2
ΔPmt1	протеин маннозилтрансфераза 21	67> 12,5	0,2 906 0,2
ΔCnaA	каталитическая субъединица кальциневрина CnaA 22,23	> 12,5	0,1	0.8	0,2	0,8	0,4
G10	исходный штамм	> 12,5	0,025	3,125	0,8	1,6			субъединица G синтазы 32	> 12,5	0,003	0,4	0,2	> 12,5	0,8
ΔAgs1	α7 1 9010 глюкан5	0,0125	0,4	0,2	> 12,5	> 12,5
ΔGel2	β (1,3) -глюканозилтрансфераза 3467 907 907 907 907 907 907 907 907 907	> 12,5	> 12,5
ATCC 13073	родительский штамм	> 12,5	0,1	0,4	0,2	> 25	3.1
S678Y	устойчивый к каспофунгину 24	3,1	1,5	0,2	0,1	> 25	3,1
R153	родительский штамм	> 12,5	0,05	0,1	0,02	0.1	0,02
ΔPkaA	каталитическая субъединица протеинкиназы A 25	0,8	0,4	0,1	0,02	0,8	0,02	0,8
0,01	0,006	0,05	0,02	0,006	ND
ΔNik109
ΔNikA hisin hisin8	0,2	0,2	0,05	1,6	0,4
ΔCalI11	GDP-транспортер маннозы (GMT) 29	0,2	0,2	0,006
ΔSwoA1	белок O -маннозилтрансфераза PmtA 30	6,2	0,05	0.2	0,006	0,2	0,01
ΔSwoM	фосфоглюкозоизомераза SwoM 31	0,4	0,1	0,4	0,1	0,4	0,1

Где разработан

Эта генная конструкция была разработана исследовательской группой «Сигнальная трансдукция в Saccharomyces cerevisiae » кафедры микробиологии II фармацевтического факультета UCM, целью которой является изучение путей MAPK в дрожжах, в основном путь целостности клеточной стенки (CWI).